水稻温敏不育基因tms5的功能分子标记及其检测引物与应用制造技术

本发明专利技术涉及水稻温敏不育基因tms5的功能分子标记及其检测引物与应用。本发明专利技术提供一种水稻温敏不育基因tms5的SNP分子标记的检测引物，所述SNP分子标记包含第71位碱基的C/A多态性，所述检测引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1～4所示的第一引物、第二引物、第三引物和第四引物。本发明专利技术利用ARMS‑PCR检测tms5基因携带的第71位碱基由C到A的功能突变，可以有效地避免假阳性，能够实现温敏不育性状的准确检测；并且检测结果可以直接根据琼脂糖凝胶电泳条带进行判断，检测程序简单易行，成本低廉，适于进行广泛推广应用。

Functional Molecular Markers of Thermosensitive Male Sterile Gene tms5 in Rice and Their Detection Primers and Applications

The present invention relates to functional molecular markers of rice thermo-sensitive male sterile gene tms5 and its detection primers and applications. The present invention provides a detection primer for the SNP molecular marker of rice thermo-sensitive male sterile gene tms5. The SNP molecular marker contains the C/A polymorphism of the 71st base, and the detection primer includes the first primer, the second primer, the third primer and the fourth primer of the nucleotide sequence such as SEQ ID NO.1-4. The invention detects the functional mutation of the seventy-first base base of the tms5 gene from C to A by using ARMS PCR, which can effectively avoid false positives and realize accurate detection of thermo sensitive male sterility. The test results can be judged directly according to the agarose gel electrophoresis strip, and the detection procedure is simple and inexpensive, and is suitable for wide application.

【技术实现步骤摘要】
水稻温敏不育基因tms5的功能分子标记及其检测引物与应用
本专利技术涉及分子生物学及植物分子育种领域，具体地说，涉及水稻温敏不育基因tms5的功能分子标记及其检测引物与应用。
技术介绍
水稻是我国最重要的粮食作物之一，全国有超过半数的人口以稻米为主食。两系法杂交水稻不育系的育性受核基因控制，具有没有恢保关系，配组自由；种子繁育程序简单，成本低；稻种资源利用率高，选育出优良组合机率高等优点，有利于使水稻杂种优势进入一个新阶段。两系法杂交稻使用的不育系主要是利用光温敏不育水稻材料培育的。目前生产上应用的两系不育系按不育基因的来源主要分为两类：光敏不育系(PGMS)和温敏不育系(TGMS)。PGMS来源于农垦58S，其代表不育系包括培矮64S，7001S等，其控制基因为pms3(DingJetal.AlongnoncodingRNAregulatesphotoperiod-sensitivemalesterility,anessentialcomponentofhybridrice.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A,2012:109:2654-2659.)。TGMS来源于安农S-1，代表的不育系有广占63S、株1S等，其不育控制基因为tms5(Zhouetal.RNaseZS1processesUbL40mRNAsandcontrolsthermosensitivegenicmalesterilityinrice.Naturecommunications,2014,5:4884.)。TMS5编码产物为RNaseZS1，RNaseZS1可以降解UbL40的mRNA；TMS5基因第71位碱基C突变为A后，导致翻译提前终止，RNaseZS1酶失活，无法降解UbL40的mRNA。低温条件下，UbL40表达量低，花粉育性正常，而高温条件下，UbL40大量表达，导致花粉不育。现有的两系不育系选育主要根据抽穗开花期的田间表现，花粉镜鉴，套袋自交等方法；还需要利用海南冬季的低温短日照和大陆的夏季的高温长日照。这种选育方式步骤繁琐、准确性低、时间长、见效慢，限制了两系不育系的选育进程。因此开发针对不育基因的分子标记，将其应用于分子标记辅助选择，可以大大提高不育系的选育效率。截止到2011年，我国种植的两系杂交稻中，有71个品种是利用带有tms5不育基因的两用不育系培育而成，占所有两系杂交稻品种的71％，其种植面积超过全国两系杂交稻种植面积的80％。科研工作者对tms5的定位、克隆和序列分析工作为tms5的分子标记开发奠定了基础。现有技术中针对水稻温敏不育系tms5基因的分子标记主要存在假阳性率高、检测步骤繁琐及检测成本较高等问题，在实际生产中仍不能得到广泛应用：曹晓风等的专利“一种快速检测水稻温敏不育系的方法”(CN201110292922.0)检测tms5基因的两对引物均不是功能标记，存在检测假阳性高的问题。专利申请CN201510967126.0、CN201610555993.8、CN201510547897.4检测tms5基因需要使用限制性内切酶酶切或者荧光探针，步骤繁琐或检测成本较高，在实际应用中有诸多不便。因此，亟需开发假阳性率低、准确性高、操作简便、成本低廉的水稻不育基因tms5的检测分子标记。
技术实现思路
为解决现有技术中存在的问题，本专利技术的目的是提供一种水稻温敏不育基因tms5的功能分子标记及其检测引物与应用。水稻温敏不育基因tms5为编码RNaseZS1蛋白的TMS5基因的第71位碱基由C突变为A，携带tms5基因的水稻表现为花粉的表型。本专利技术针对第71位碱基由C突变为A的SNP位点，开发基于碱基不互补耐热DNA聚合酶不延伸原理的突变扩增系统(ARMS-PCR)检测引物和检测方法。一方面，本专利技术提供一种水稻温敏不育基因tms5的SNP分子标记的检测引物，所述SNP分子标记包含第71位碱基的C/A多态性，所述检测引物包括第一引物、第二引物、第三引物和第四引物；所述第一引物和所述第二引物分别为所述第71位碱基的上下游外侧扩增引物，所述第三引物的3’末端的最后1个碱基与tms5基因非编码链的第71位碱基T互补，所述第四引物的3’末端的最后1个碱基与TMS5基因编码链的第71位碱基C互补。其中，TMS5基因为第71位碱基未发生突变的野生型基因(即第71位碱基为C)。优选的，所述检测引物的核苷酸序列如下：第一引物：SEQIDNO.1：AACCGGTAATGTCGTAAGGAAATG；第二引物：SEQIDNO.2：GGCGTGGGAGATGAAGAGGAA；第三引物：SEQIDNO.3：GCCGCCACCGGGTCGGCCGAAGTA；第四引物：SEQIDNO.4：CGGTGAGGGGCGGCGCCTTCG。另一方面，本专利技术提供一种水稻温敏不育基因tms5的检测方法，为利用ARMS-PCR对tms5的SNP分子标记进行扩增，根据电泳检测扩增产物的条带分型，判断tms5基因的有无或杂/纯合；所述ARMS-PCR的引物为本专利技术所述的检测引物。具体的，水稻温敏不育基因tms5的检测方法包括如下步骤：(1)提取待测水稻的基因组DNA；(2)以待测水稻的基因组DNA为模板，利用本专利技术所述的检测引物，采用ARMS-PCR进行扩增；(3)电泳检测ARMS-PCR扩增产物，根据扩增产物的条带分型判断tms5基因的有无或杂/纯合。优选的，所述判断tms5基因的有无或杂/纯合的方法如下：如果扩增产物条带为大小分别为468bp/474bp和184bp的两条带，判定所述待检测水稻样本含有纯和的tms5基因；如果扩增产物条带为大小分别为468bp/474bp、329bp/335bp及184bp的三条带，判定所述待检测水稻样品含有杂合的TMS5/tms5基因；如果扩增产物条带为大小分别为468bp/474bp和329bp/335bp的两条带，判定所述待检测水稻样本不含有tms5基因。水稻的不同品种的TMS5基因序列存在一定差异，一部分品种的TMS5缺失了两个氨基酸(核苷酸序列缺失了6bp)，另一部分品种则没有缺失这两个氨基酸(这两个氨基酸的缺失不影响育性)，因此，采用同一外侧引物(第一、第二引物)与SNP位点特异的第三或第四引物组成的引物对进行扩增时，扩增产物的大小会产生6bp大小的差异，即出现上述468bp/474bp和329bp/335bp的情况。具体判定时，例如，扩增产物条带为大小分别为468bp和184bp的两条带或者扩增产物条带为大小分别为474bp和184bp的两条带，均判定所述待检测水稻样本含有纯和的tms5基因。本专利技术中，所述ARMS-PCR的反应程序如下：94℃～98℃预变性3～10min；94℃～98℃变性30s～60s，52℃～60℃退火30s，72℃延伸45s～60s，28～35个循环；72℃延伸3～10min。作为本专利技术的优选实施方式，所述ARMS-PCR的反应程序如下：94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸45s，35个循环；72℃延伸5min。本专利技术中，所述ARMS-PCR的20μL的反应体系包括如下组分：基因组DNA0.5～4.0μL，DNA聚合酶Buffer4本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种水稻温敏不育基因tms5的SNP分子标记的检测引物，其特征在于，所述SNP分子标记包含第71位碱基的C/A多态性，所述检测引物包括第一引物、第二引物、第三引物和第四引物；所述第一引物和所述第二引物分别为所述第71位碱基的上下游外侧扩增引物，所述第三引物的3’末端的最后1个碱基与tms5基因非编码链的第71位碱基T互补，所述第四引物的3’末端的最后1个碱基与TMS5基因编码链的第71位碱基C互补。

【技术特征摘要】
1.一种水稻温敏不育基因tms5的SNP分子标记的检测引物，其特征在于，所述SNP分子标记包含第71位碱基的C/A多态性，所述检测引物包括第一引物、第二引物、第三引物和第四引物；所述第一引物和所述第二引物分别为所述第71位碱基的上下游外侧扩增引物，所述第三引物的3’末端的最后1个碱基与tms5基因非编码链的第71位碱基T互补，所述第四引物的3’末端的最后1个碱基与TMS5基因编码链的第71位碱基C互补。2.根据权利要求1所述的检测引物，其特征在于，其核苷酸序列如下：第一引物：SEQIDNO.1：5’-AACCGGTAATGTCGTAAGGAAATG-3’；第二引物：SEQIDNO.2：5’-GGCGTGGGAGATGAAGAGGAA-3’；第三引物：SEQIDNO.3：5’-GCCGCCACCGGGTCGGCCGAAGTA-3’；第四引物：SEQIDNO.4：5’-CGGTGAGGGGCGGCGCCTTCG-3’。3.一种水稻温敏不育基因tms5的检测方法，其特征在于，利用ARMS-PCR对tms5的SNP分子标记进行扩增，根据电泳检测扩增产物的条带分型，判断tms5基因的有无或杂/纯合；所述ARMS-PCR的引物采用如权利要求1或2所述的检测引物。4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)提取待测水稻的基因组DNA；(2)以待测水稻的基因组DNA为模板，利用如权利要求1或2所述的检测引物，采用ARMS-PCR进行扩增；(3)电泳检测ARMS-PCR扩增产物，根据扩增产物的条带分型判断tms5基因的有无或杂/纯合。5.根据权利要求3或4所述的检...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨远柱，刘兰兰，王黛君，曾冬冬，王凯，周延彪，符辰建，秦鹏，
申请(专利权)人：袁隆平农业高科技股份有限公司，湖南隆平高科种业科学研究院有限公司，湖南亚华种业科学研究院，
类型：发明
国别省市：湖南,43