精确测定中华绒螯蟹线粒体全基因组序列的方法技术

本发明专利技术涉及精准测定中华绒螯蟹线粒体全基因组序列的方法和由该方法得到的全基因组序列。该方法包括步骤：(1)提取中华绒螯蟹肌肉组织中的全基因组DNA，构建基因文库，利用第二代测序技术进行测序；(2)参考近缘物种线粒体全基因组序列对测序读段进行筛选，除去核DNA片段，然后进行线粒体基因组的拼接，再对拼接的线粒体基因组的编码蛋白基因、rRNA和tRNA进行预测注释；(3)将拼装好的线粒体基因组序列和近缘缘物种线粒体基因组序列比对，根据保守区，再参考所述近缘物种的线粒体全基因组序列设计引物，对对应的第二代测序样品进行PCR扩增，利用第一代测序技术测序PCR扩增产物，校正拼接的线粒体基因组序列。该方法具有快速、准确的优点。

A Method for Accurate Sequencing of Mitochondrial Whole Genome of Eriocheir sinensis

The invention relates to a method for accurately determining the whole mitochondrial genome sequence of Eriocheir sinensis and the whole genome sequence obtained by the method. The method includes: (1) extracting whole genome DNA from muscle tissue of Eriocheir sinensis, constructing gene library and sequencing with second generation sequencing technology; (2) screening sequence reading segments with reference to the whole mitochondrial genome sequence of related species, removing nuclear DNA fragments, then splicing mitochondrial genome, and then splicing the coding protein genes and rRNA of the spliced mitochondrial genome. Predictive annotation with tRNA; (3) Mitochondrial genome sequences of assembled and related species were aligned, primers were designed according to conservative regions, and the whole mitochondrial genome sequences of the related species were referred to. The corresponding second-generation sequencing samples were amplified by PCR, and the amplified products were sequenced by first-generation sequencing technology to correct the spliced mitochondrial genome sequences. Column. This method is fast and accurate.

【技术实现步骤摘要】
精确测定中华绒螯蟹线粒体全基因组序列的方法
本专利技术属于生物
，具体地说，涉及一种精确测定中华绒螯蟹线粒体全基因组序列方法以及由该方法测得的中华绒螯蟹线粒体全基因组序列。
技术介绍
线粒体具有双层膜结构以及独特的DNA分子，也是动物细胞中唯一具有“染色体外”基因组的半自主性细胞器，同时其也具有完整遗传信息传递与表达系统的能力。近年来，线粒体基因组已经成为非常有特点的分子标记，因为其具有一些独特的性质，比如：分子量较小、结构简单、母系遗传、无内含子、进化率高以及无基因重组等等。由于线粒体结构功能和遗传的重要性和特殊性，线粒体DNA在系统发育学、分子进化学和遗传学等方面得到了广泛的应用。目前，对线粒体DNA序列进行测序主要分为三大类方法：第一代测序、第二代测序和第三代测序。第一代测序技术的主要特点是测序读长可达1000bp，准确性高达99.999％，但其测序成本高，通量低等方面的缺点，严重影响了其真正大规模的应用。因而第一代测序技术并不是最理想的测序方法。第二代测序技术(又称“高通量测序技术”)大大降低了测序成本，并且大幅提高了测序速度，但是读取片段(200bp–500bp)让其本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种精准测定中华绒螯蟹线粒体全基因组序列的方法精准测定中华绒螯蟹线粒体全基因组序列的方法，其特征在于，该方法基于高通量测序，包括以下步骤：(1)提取所述中华绒螯蟹肌肉组织中的全基因组DNA，构建基因文库，利用第二代测序技术进行测序；(2)通过参考近缘物种线粒体全基因组序列对高质量的测序读段进行筛选，除去核DNA片段，然后进行线粒体基因组的拼接，选取最优的拼接结果，再对拼接好的线粒体基因组的编码蛋白基因、rRNA和tRNA进行预测注释；(3)将拼装好的线粒体基因组序列和近缘物种线粒体基因组序列比对，根据保守区，再参考所述近缘物种的线粒体全基因组序列设计引物，对对应的第二代测序样品进行PCR扩...

【技术特征摘要】
1.一种精准测定中华绒螯蟹线粒体全基因组序列的方法精准测定中华绒螯蟹线粒体全基因组序列的方法，其特征在于，该方法基于高通量测序，包括以下步骤：(1)提取所述中华绒螯蟹肌肉组织中的全基因组DNA，构建基因文库，利用第二代测序技术进行测序；(2)通过参考近缘物种线粒体全基因组序列对高质量的测序读段进行筛选，除去核DNA片段，然后进行线粒体基因组的拼接，选取最优的拼接结果，再对拼接好的线粒体基因组的编码蛋白基因、rRNA和tRNA进行预测注释；(3)将拼装好的线粒体基因组序列和近缘物种线粒体基因组序列比对，根据保守区，再参考所述近缘物种的线粒体全基因组序列设计引物，对对应的第二代测序样品进行PCR扩增测序，PCR产物利用第一代测序技术进行，最后对拼接的线粒体基因组序列进行校正，即可获得中华绒螯蟹线粒体全基因组序列。2.根据权利要求1所述的精准测定中华绒螯蟹线粒体全基因组序列的方法精准测定中华绒螯蟹线粒体全基因组序列的方法，其特征在于，步骤(1)中提取所述中华绒螯蟹肌肉组织中的全基因组DNA使用的是苯酚/氯仿法。3.根据权利要求1所述的精准测定中华绒螯蟹线粒体全基因组序列的方法精准测定中华绒螯蟹线粒体全基因组序列的方法，其特征在于，步骤(2)中所述近缘物种是日本绒螯蟹(Eriocheirjaponica)、肉球近方蟹(Hemigrapsussanguineus)、伍氏厚蟹(Helicanawuana)和中华绒螯蟹(Eriocheirsinensis)。4.根据权利要求1所述的精准测定中华绒螯蟹线粒体全基因组序列的方法，其特征在于，步骤(2)中线粒体基因组的拼接是利用NOVOPlasty拼接软件进行多Kmer参数的拼接。5.根据权利要求1所述的精准测定中华绒螯蟹线粒体全基因组序列的方法，其特征在于，步骤(2)中对线粒体基因组的编码蛋白基因、rRNA和tRNA进行预测注释分别利用blast软件、Barrnap0.4.2和tRNAscan-SEv1.3.1软件。6.根据权利要求1所述的精准测定中华绒螯蟹线粒体全基因组序列的方法，其特征在于，其特征在于，步骤(3)中所述PCR扩增所用引物包括以下19对引物：第1对引物：F:SEQIDNO.1和R:SEQIDNO.2，第2对引物：F:SEQIDNO.3和R:SEQIDNO.4，第3对引物：F:SEQIDNO.5和R:SEQIDNO.6，第4对引物：F:SEQIDNO.7和R:SEQIDNO.8，第5对引物：F:SEQIDNO.9和R:SEQIDNO.10，第6对引物：F:SEQIDNO.11和R:SEQIDNO.12，第7对引物：F:SEQIDNO.13和R:SEQIDNO.14，第8对引物：F:SEQIDNO.15和R:SEQIDNO.16，第9对引物：F:SEQIDNO.17和R:SEQIDNO.18，第10对引物：F:SEQIDNO.19和R:SEQIDNO.20，第11对引物：F:SEQIDNO.21和R:S...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴旭干，张成，成永旭，
申请(专利权)人：上海海洋大学，
类型：发明
国别省市：上海,31