一种移植用牙髓间充质干细胞微球的制备体系制造技术

本发明专利技术公开一种移植用牙髓间充质干细胞微球的制备体系。该制备体系采用可摇动装置使细胞置于三维培养环境中，能够促使牙髓间充质干细胞形成三维立体球状结构，更好地保持培养细胞的干性，利于其在组织损伤修复的移植中发挥作用。

A preparation system of dental pulp mesenchymal stem cell microspheres for transplantation

The invention discloses a preparation system of dental pulp mesenchymal stem cell microspheres for transplantation. The preparation system uses a shaking device to place cells in a three-dimensional culture environment, which can promote the formation of three-dimensional spherical structure of dental pulp mesenchymal stem cells, better maintain the dryness of cultured cells, and help them play a role in the transplantation of tissue damage repair.

【技术实现步骤摘要】
一种移植用牙髓间充质干细胞微球的制备体系
本专利技术属于干细胞
，涉及一种牙髓间充质干细胞微球的制备及其移植方法。
技术介绍
干细胞是一种具有自我更新能力和多系分化潜能的原始细胞，是细胞移植的理想细胞。在个体发育过程中，存在各种形式的干细胞，如胚胎干细胞，多能干细胞以及各种组织中的定向干细胞如造血干细胞、神经干细胞等。但在实际应用上却面临伦理的挑战或取材的限制。间充质干细胞（MSC）是存在于人体组织中具有多系分化潜能的一种亚全能干细胞群，因其在特定环境下可诱导分化为多种组织细胞，具有免疫原性低，移植后能形成稳定嵌合等特点，故可作为一种理想的供异体移植的细胞。牙髓间充质干细胞（dentalpulpstemcells,DPSCs）是从牙髓组织中分离得到的一类具有高增殖能力、高度自我更新能力、多向分化能力的细胞。2000年首次发现了牙髓间充质干细胞，Gronthos等发现在离体的乳牙和智齿中都存在牙髓间充质干细胞。人类有20颗乳牙，在乳恒牙交替期会逐渐自然脱落，牙髓组织来源非常易得，且无创伤。并且还具有以下优势：牙髓组织源于自体组织，无免疫排斥反应，能用于组织与器官再生与修复；具有刺激病变组织治愈病变自身；具有免疫调节和抗炎特性；DPSCs能够在体外稳定增殖且衰亡率低；少量组织即可获取大量干细胞，适宜大规模培养，对机体损伤小等优点。已有研究利用该细胞成功地构建牙髓、牙本质以及牙齿组织，最新研究表明，牙髓间充质干细胞对于肠道炎症疾病的治疗有明显的优势。牙髓间充质干细胞分离、培养技术的完善将推动其进行疾病治疗。目前，临床实验采用的牙髓间充质干细胞移植方法为将牙髓间充质干细胞在体外进行培养、扩增后制备成单细胞悬液，然后将单细胞悬液注射至患处，此种方法由于注入的是单细胞悬液，注入到患者体内的单细胞容易分散到身体的其他部位；除此之外，目前还有一种干细胞微球的制备方法，此方法一般为在培养瓶或培养皿的底部铺一层琼脂糖凝胶使细胞不能贴壁生长而形成微球体，但是此方法操作繁琐，且不适合大规模生产。为克服上述缺点，本专利技术提供一种能够更好地保持干细胞生物学特性，且操作简单、适合大规模生产的牙髓间充质干细胞微球的制备方法并用于移植到患者体内，移植后的细胞微球体不易扩散至身体其他部位，便于临床操作，在牙髓组织的修复和牙齿组织工程中有广阔的应用前景，并有可能取代现有的牙齿缺损或缺失的治疗方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种移植用牙髓间充质干细胞微球的制备方法。用普通培养方法将牙髓间充质干细胞培养至1-6代，当细胞融合度达到70~90%时进行传代培养，传代培养的细胞经洗涤、消化后接种在新的细胞培养瓶或细胞培养皿中，将装有新传代细胞的培养瓶或培养皿放入转速为50~300rpm的牙髓干细胞三维培养装置中，使放在其上的培养瓶或培养皿能够恒速摇摆，摇摆培养装置放入37℃，5%CO2细胞培养箱中。待牙髓间充质干细胞微球直径达40~200um时，用移液管吸取至离心管中，用离心机以300~800rpm转速离心2~10min，后用0.1-30毫升0.9%生理盐水重悬牙髓间充质干细胞微球沉淀，再用0.5-3mm针孔注射器将微球体悬液吸入后，注射到患处。整个专利技术包含2个步骤：1）牙髓间充质干细胞微球的制备上述方法中，所培养的牙髓间充质干细胞代数为第1~6代。上述方法中，当所培养的牙髓间充质干细胞融合度达到70-90%时进行传代培养。上述方法中，传代培养的细胞经洗涤、消化后以4×104~1×106个的密度接种于新的细胞培养瓶或培养皿中。上述方法中，将装有新传代细胞的培养瓶或培养皿放入干细胞三维培养体系中。上述方法中，干细胞培养体系以转速为50~300rpm的某一转速恒速摇摆，使放在其上的培养瓶或培养皿能够恒速摇摆。上述方法中，干细胞培养体系放入37℃，5%CO2细胞培养箱中。牙髓间充质干细胞微球的移植2）上述方法中，将牙髓间充质干细胞微球培养至直径为40~200um。上述方法中，将40~100um牙髓间充质干细胞微球悬液用移液管吸取至离心管中。上述方法中，将离心管中的牙髓间充质干细胞微球用离心机以300~800rpm转速离心2~10min。上述方法中，用0.1-30毫升0.9%生理盐水重悬牙髓间充质干细胞微球沉淀。上述方法中，用0.5-3mm针孔注射器将微球体吸入后，注射到患处。附图说明图1是牙髓间充质干细胞微球培养24小时形态图（10×）图2是牙髓间充质干细胞贴壁培养与微球培养干性因子表达情况图图3是牙髓微球间充质干细胞培养3天后流式细胞检测图，CD34(-)，CD45(-)，CD90(+)，HLA-DR（-）图4是牙髓微球间充质干细胞培养3天进行21天成脂成骨诱导。A，细胞诱导分化为脂肪细胞，油红O染色；B，细胞诱导分化为骨细胞，茜素红染色。具体实施方式下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。实施例1、人牙髓间充质干细胞微球的制备及移植试剂本专利技术中的培养干细胞用的试剂为常规市售产品，例如，干细胞生长因子购自peprotech，胰蛋白酶购自Gibco，胎牛血清购自Gibco，完全培养基：F12基础培养基+10%体积百分比的胎牛血清+干细胞生长因子。人牙髓间充质干细胞微球的制备用普通方法培养原代牙髓间充质干细胞至第1~6代，当细胞融合度达到70-90%时进行传代培养，细胞经洗涤、消化后接种在新的培养瓶或培养皿中，并将培养瓶或培养皿放入干细胞三维培养体系，将此装置以转速为40~200um的某一转速恒速摇摆，使放在其上的培养瓶或培养皿能够恒速摇摆，放入细胞培养箱中，培养温度为37℃，CO2浓度为5%。牙髓间充质干细胞可成球生长，如图1，生长直径为40~200um。成球生长的牙髓间充质干细胞体现出更好的干性维持，如图2与未成球的牙髓间充质干细胞相比，其干性因子Oct-4，Sox2，Nanog的表达增高。成球生长的牙髓间充质干细胞能够保持间充质干细胞的特性，如图3显示成球培养的牙髓间充质干细胞流式细胞分析，其CD34(-)，CD44(+)，，CD90(+)，HLA-DR（-）；如图4显示成球培养的牙髓间充质干细胞可诱导分化成为脂肪细胞，骨细胞。人牙髓间充质干细胞微球的移植待细胞微球体扩增至直径为40-200um时，用移液管吸取至离心管中，用离心机以300~800rpm转速离心2~10min，后用0.1-30毫升0.9%生理盐水重悬牙髓间充质干细胞微球沉淀，再用1mm针孔注射器将微球体悬液吸入后，注射到牙周炎模型小鼠患处；同时，将相同浓度的0.1-30毫升牙髓间充质干细胞单细胞悬液注射到对照组牙周炎模型小鼠患处。牙髓干细胞微球可用于牙髓干细胞的移植。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.人牙髓间充质干细胞的制备，采用了一种三维摆动培养体系。

【技术特征摘要】
1.人牙髓间充质干细胞的制备，采用了一种三维摆动培养体系。2.根据权利要求1所述的牙髓间充质干细胞微球的摇摆培养体系，其特征在于该体系能够使牙髓间充质干细胞不贴壁生长，并能形成三维球状立体结构。3.根据权利要求2所述的牙髓间充质干细胞微球的摇摆培养体系，其特征在于该体系包含有1-10个水平放置的摇摆槽，能够将多个培养瓶或培养皿水平地放在该摇摆槽内。4.根据权利要求3所述的牙髓间充质干细胞微球的培养体系，其特征在于该体系能够保持恒定的转速，在一定空间内摇摆，且转速范围为50~300rpm。5.根据权利要求4所述的牙髓间充质干细胞微球的培养体系，其特征在于该体系能够与细胞培养箱兼容。6.根据权利要求5所述的牙髓间充质干细胞微球的制备方法，接种于细胞培养瓶或细胞培养皿中，牙髓间充质干细胞的密度为4×...

【专利技术属性】
技术研发人员：不公告发明人，
申请(专利权)人：中晶生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11