制备人绒毛膜干细胞培养液的方法及其应用技术

本发明专利技术公开一种制备人绒毛膜干细胞培养液的方法及其应用，包括以下步骤：使用胰酶消化对数生长期的JEG‑3人绒毛膜细胞；终止消化，利用无血清悬浮培养法富集细胞悬液中的人绒毛膜干细胞，获得JEG‑3悬浮细胞球悬液；利用胰酶和EDTA进行消化，终止消化后，加入干细胞培养基传代培养，培养过程中提供照射剂量率为165.44cGy/min的2～4Gy剂量钴

【技术实现步骤摘要】
制备人绒毛膜干细胞培养液的方法及其应用
本专利技术涉及干细胞技术应用，具体地，涉及制备人绒毛膜干细胞培养液的方法及其应用。
技术介绍
20世纪70年代，研究发现一种来源于中胚层、具有成纤维细胞样的贴壁细胞，即间充质干细胞，由于间充质干细胞具备很强的自我增殖能力和多分化潜能，已迅速成为国内外的研究热点，目前国外已有多项间充质干细胞相关应用制剂应用于临床的研究，且更多的临床试验正在进行或申请。目前已经从骨髓、脂肪、牙髓、羊膜、绒毛膜、蜕膜、脐带、脐血、羊水、睾丸、扁桃体等组织中分离提取出间充质干细胞。间充质干细胞促进组织再生的机制包括分化和旁分泌两方面的作用。分化机制认为，间充质干细胞迁移到损伤部位，分化为与受区细胞相似表型的细胞，通过移植替代修复受损组织；旁分泌机制认为，间充质干细胞分泌的生长因子、细胞因子和趋化因子影响受区多种细胞的存活、增殖、迁移和基因表达，而且作用效果有组织特异性。目前的研究认为，由于间充质干细胞移植后成活率较低，间充质干细胞通过分化发挥替代修复的作用有限。数天甚至数小时内短暂而明显的抗炎和促进增殖作用，很难用间充质干细胞的分化修复来解释。此外，无细胞条件培养基具有改善受损组织功能的作用，同样也支持间充质干细胞的旁分泌机制。大量研究表明，相比组织构建，间充质干细胞通过复杂的旁分泌功能促进组织再生的作用可能更为关键。目前所报道的间充质干细胞主要来源于骨髓，采用密度梯度离心法获得。虽然分离方法简便，但供者取髓需要经历一个比较痛苦的手术，并在取材过程中及取材后会有很高的感染机会；由于人体骨髓中间充质干细胞的含量极其稀少，每105-106个单个核细胞中大约只有1个，而且随着年龄的增加，骨髓中间充质干细胞的数量、增殖和分化能力均显著下降，使其在研究和应用尤其是临床应用中受到限制。有研究表明，起源于胚胎发育期胚外中胚层的胎盘是由间质、血管及滋养细胞组成，含有大量的间充质成分，胎盘来源的间充质干细胞和骨髓来源的间充质干细胞具有相同的生物学特性。而且，胎盘作为分娩后的废弃物，不存在侵入性的获取过程，且与传统骨髓间充质干细胞相比，具有更强的增殖能力。人胎盘绒毛膜中含有丰富的干细胞，可作为一个崭新而丰富的来源，为实验研究和临床提供干细胞。胎盘是胎儿发育的营养来源，最近的报告揭示了胎盘细胞上清液中存在丰富的活性因子，如碱性纤维母细胞生长因子(b-FGF)、表皮生长因子(EGF)、和转化生长因子-β(TGF-β)等，这些细胞因子具有促进创伤愈合及组织再生的特性，这为皮肤抗老化的预防治疗提供了新的方法。培养人绒毛膜干细胞(CDSC)，得到的人绒毛膜干细胞培养液(CDSC-CNM)中含有b-FGF、EGF、TGF-β、IL-6及IL-8等多种活性成分。将CDSC-CNM作用于光老化表皮细胞，有望可以使光老化表皮细胞得到修复再生。目前，脂肪和骨髓来源的干细胞分泌因子己被用来治疗皮肤皱纹，而来源于人类胎盘的干细胞对于光老化的修复潜力尚缺乏研宄。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种制备人绒毛膜干细胞培养液的方法及其应用，以解决上述技术问题中的至少一个。根据本专利技术的一个方面，提供一种制备人绒毛膜干细胞培养液的方法，包括以下步骤：步骤a.使用0.25vol％胰酶消化处于对数生长期的JEG-3人绒毛膜细胞系；步骤b.移除胰酶消化液终止消化，利用无血清悬浮培养法富集含有JEG-3人绒毛膜细胞系的细胞悬液中的人绒毛膜干细胞，获得JEG-3悬浮细胞球悬液；步骤c.利用0.05％胰酶和0.02％EDTA对JEG-3悬浮细胞球悬液进行消化，终止消化后，加入干细胞培养基传代培养，传代培养过程中提供2～4Gy剂量钴60γ射线照射，照射剂量率为165.44cGy/min，并加入基质细胞衍生因子-1α，获得人绒毛膜干细胞培养物；步骤d.将人绒毛膜干细胞培养物离心，过滤，除去人绒毛膜干细胞，得到滤液即为人绒毛膜干细胞培养液。优选地，在步骤c的培养过程中加入0.2mg/L基质细胞衍生因子-1α。优选地，在步骤c中，提供4Gy剂量的钴60γ射线照射。本专利技术还提供采用上述的方法制备的人绒毛膜干细胞培养液。本专利技术还提供采用上述的人绒毛膜干细胞培养液在护肤美容用品中的应用。本专利技术还提供一种护肤美容用品，其特征在于：含有上述的人绒毛膜干细胞培养液。优选地，护肤美容用品包括清洁类产品、美白除皱类产品以及化妆类产品。优选地：清洁类产品包括洗手液、沐浴产品、洗发护发产品、洁面产品和卸妆产品；美白除皱类产品包括：润肤霜、爽肤水、收缩水、化妆水、乳液、日霜、晚霜、精华液、眼霜、护手霜、防裂膏、营养液；化妆类产品包括：妆前乳、隔离霜、粉底霜、唇膏、胭脂、花露水、香粉和面膜。优选地，护肤美容用品为修复营养液，除了水分，其含有重量百分比为50～75％的所述人绒毛膜干细胞培养液，且还含有如下重量百分比组分：本专利技术通过无血清悬浮培养法富集人绒毛膜干细胞，富集过程操作简单、成本低、所需器件常见，由此富集得到的人绒毛膜干细胞比率高，且不带毒性，其功能也不受富集过程操作影响。另外，本专利技术通过在CDSCs的培养过程中，提供钴60γ射线照射，且添加了基质细胞衍生因子-1α，可以极大地促进CDSCs的旁分泌功能，由此培养得到CDSC-CNM中各种生长因子含量高于亲代JEG-3人绒毛膜细胞系。本专利技术培养的CDSC-CNM对光老化细胞有显著的修复作用，将其作为活性成分添加到美容护肤品中，可制备有修复效果的营养液。附图说明图1为显微镜下观察JEG-3人绒毛膜细胞系接种于无血清培养基后的生长情况；图2为流式细胞仪分析CDSCs表面标志物鉴定结果；图3为CDSC-CNM中的细胞因子分析结果；图4为光老化HaCaT细胞与正常HaCaT细胞的增殖率；图5为不同浓度CDSC-CNM作用后的HaCaT细胞活性；图6为HaCaT细胞经不同浓度CDSC-CNM作用后的荧光强度值；图7为不同浓度CDSC-CNM作用光老化HaCaT细胞后的尾核比例。具体实施方式为了使本
的人员更好地理解本专利技术方案，下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分的实施例，而不是全部的实施例。实施例11.1人绒毛膜干细胞培养液(CDSC-CNM)的制备无血清培养基的配制将2μgEGF、2μgbFGF、2mlB27、400μgBSA、400μg胰岛素、1ml青链霉素混合液移至100ml已灭菌好的玻璃血清瓶中，DMEM培养基定容至100ml，即配制成干细胞培基，混匀、封装后置4℃冰箱备用。细胞计数方式准备一块清洁的细胞计数板，将盖玻片盖于计数槽上。将待测细胞制成单细胞悬液吹打混匀后，吸出5～10μL沿盖玻片边缘缓缓滴入，细胞悬液利用毛细管作用虹吸进入盖玻片下的计数槽内，充满盖玻片和计数板。保证盖玻片下无气泡，也避免让悬液流入旁边的小槽中。将计数器置于显微镜下观察，当看到视野中出现计数方格后，将四个大方格(每个大方格含有16个中格)中的细胞总数全部计数，压线的细胞记左不计右，记上不记下，出现两个以上细胞组成的细胞团则按单个细胞计数，若细胞团占10％以上说明细胞未消化好，吹打不够均匀，需重新制备悬液。细胞计数公式：细胞密度＝四大格细胞总数/4×104细胞总数＝四大格细胞总数/4本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种制备人绒毛膜干细胞培养液的方法，包括以下步骤：步骤a.使用0.25vol％胰酶消化处于对数生长期的JEG‑3人绒毛膜细胞系；步骤b.移除胰酶消化液终止消化，利用无血清悬浮培养法富集含有所述JEG‑3人绒毛膜细胞系的细胞悬液中的人绒毛膜干细胞，获得JEG‑3悬浮细胞球悬液；步骤c.利用0.05％胰酶和0.02％EDTA对所述JEG‑3悬浮细胞球悬液进行消化，终止消化后，加入干细胞培养基传代培养，传代培养过程中提供2～4Gy剂量钴60γ射线照射，照射剂量率为165.44cGy/min，并加入基质细胞衍生因子‑1α，获得人绒毛膜干细胞培养物；步骤d.将所述人绒毛膜干细胞培养物离心，过滤，除去人绒毛膜干细胞，得到滤液即为所述人绒毛膜干细胞培养液。

【技术特征摘要】
1.一种制备人绒毛膜干细胞培养液的方法，包括以下步骤：步骤a.使用0.25vol％胰酶消化处于对数生长期的JEG-3人绒毛膜细胞系；步骤b.移除胰酶消化液终止消化，利用无血清悬浮培养法富集含有所述JEG-3人绒毛膜细胞系的细胞悬液中的人绒毛膜干细胞，获得JEG-3悬浮细胞球悬液；步骤c.利用0.05％胰酶和0.02％EDTA对所述JEG-3悬浮细胞球悬液进行消化，终止消化后，加入干细胞培养基传代培养，传代培养过程中提供2～4Gy剂量钴60γ射线照射，照射剂量率为165.44cGy/min，并加入基质细胞衍生因子-1α，获得人绒毛膜干细胞培养物；步骤d.将所述人绒毛膜干细胞培养物离心，过滤，除去人绒毛膜干细胞，得到滤液即为所述人绒毛膜干细胞培养液。2.如权利要求1所述制备人绒毛膜干细胞培养液的方法，其特征在于：在所述步骤c的培养过程中加入0.2mg/L基质细胞衍生因子-1α。3.如权利要求1所述制备人绒毛膜干细胞培养液的方法，其特征在于：...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏色东，
申请(专利权)人：深圳市乔水生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44