一种从脐带组织中分离间充质干细胞的方法技术

本发明专利技术公开了一种从脐带组织中分离间充质干细胞的方法，包括以下步骤：脐带采集与运输；脐带组织的预处理；对脐带华通胶组织块进行贴壁培养。本发明专利技术通过分离方法，探索一种高效连续，能够利用宝贵而有限的脐带组织，最大限度的提高脐带组织利用率以及间充质干细胞获得率、纯化率的同时，缩短间充质干细胞获得周期的方法和路径。

A Method for Isolating Mesenchymal Stem Cells from Umbilical Cord Tissue

The invention discloses a method for separating mesenchymal stem cells from umbilical cord tissue, which comprises the following steps: umbilical cord collection and transportation; pretreatment of umbilical cord tissue; adherent culture of umbilical cord Huatong glue tissue block. By means of separation method, the invention explores an efficient and continuous method and path for shortening the acquisition cycle of mesenchymal stem cells while maximizing the utilization rate of umbilical cord tissue and the acquisition and purification rate of mesenchymal stem cells by utilizing precious and limited umbilical cord tissue.

【技术实现步骤摘要】
一种从脐带组织中分离间充质干细胞的方法
本专利技术属于再生医学生物
，具体地说，涉及一种从脐带组织中分离间充质干细胞的方法。
技术介绍
脐带间充质干细胞(MesenchymalStemCells,MSCs)是指存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞，它能分化成许多种组织细胞，具有广阔的临床应用前景。脐带间充质干细胞(MSCs)具有较高的分化潜能，可向多个方向进行分化。它在骨，软骨，肌肉，肌腱，韧带，神经，肝，内皮和心肌等组织工程方面具有广阔的临床应用前景。目前从脐带中分离间充质干细胞的主要方法有组合酶消化法和组织块贴壁法。酶消化法普遍采用0.25％胰蛋白酶+0.1％胶原酶I型等体积混合对剪碎的脐带组织进行过夜消化10-24小时，经过离心分离获得间充质干细胞基质层成分，接种于内表面处理后的培养耗材中，添加适量的干细胞完全培养基，放入二氧化碳培养箱5.0％37℃培养；其缺点是脐带间充质干细胞大部分被消化酶消化裂解，脐带组织只能利用一次，间充质干细胞获得率低，由于消化残留的血管内皮和表皮组织存在导致分离出的原代间充质干细胞纯度很低同时残留酶对细胞生长也有较大的抑制作用。传统贴壁法，采用PBS液体或0.9％生理盐水反复多次洗净脐带组织中的脐带血后，采用组织粉碎机破碎或医用组织器械剪碎，直接贴壁到表面贴壁处理后的培养耗材中，加入干细胞完全培养基铺满包围所有贴壁组织块，放入二氧化碳培养箱5.0％37℃培养，每隔3-5天换一次液直至原代细胞长满(需要10-15天)；原代长满后，将贴壁的组织块废弃处理，原代细胞传代扩增培养；其缺点是由于没有去除脐带表皮组织和脐带内血管组织，脐带分离获得原代间充质干细胞的周期较大大延长(至少10-15天，原代干细胞才能达到传代扩增水平)，同时原代间充质干细胞长出伴随着大量的表皮细胞和血管内皮成纤维细胞，从而使目的细胞纯度大大很低，传统贴壁法贴壁一次后，贴壁脐带组织被废弃掉也导致脐带组织利用率很低，难以满足未来市场化的需求。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了一种从脐带组织中分离间充质干细胞的方法。为了解决上述技术问题，本专利技术公开了一种从脐带组织中分离间充质干细胞的方法，包括以下步骤：步骤1、脐带采集与运输；步骤2、脐带组织的预处理；步骤3、对脐带华通胶组织块进行贴壁培养。可选地，所述步骤1中的脐带采集与运输具体为：按照无菌操作要求采集脐带，符合脐带供者采集标准，长度不小于15厘米，保持完整，无针眼及破损，尽量避免脐带与其他物品接触，浸入采集瓶的保存液中，密封标注，4°低温转运箱尽快送往实验室，整个过程不超过12小时。可选地，所述步骤2中的脐带组织的预处理具体为：步骤2.1、提前半小时将生物安全柜开机，窗口调至工作位置等待绿色LED“稳定气流”亮起，将脐带用止血钳从采集瓶中无菌取出，放入生物安全柜操作台内准备好的玻璃皿中，75％酒精浸没处理2分钟；步骤2.2、用止血钳夹出脐带转移入新的皿中，0.9％生理盐水浸没清洗一遍，并用手术剪将脐带组织剪成2cm长组织块，用敷料镊挤出组织块中残留血液；步骤2.3、用0.9％生理盐水反复清洗组织块，2-3次，直到浸没组织的生理盐水澄清透明；步骤2.4、用2把组织镊将组织块的表皮组织和血管内皮组织剔除干净，保留华通胶组织，放入无菌的新皿中；直至所有的组织块处理完毕，用医用手术剪，将收集的华通胶组织剪碎成2-5mm的华通胶块，以备贴壁培养。可选地，所述步骤3中的对脐带华通胶组织块进行贴壁培养具体为：步骤3.1、配置间充质干细胞完全培养基；步骤3.2、准备用于步骤2.4收集待贴壁华通胶组织块的T75cm2培养瓶，将华通胶组织块按间隔1-2cm间距贴在T75cm2培养瓶底面，放入37℃5.0％CO2培养箱中孵育30分钟蒸发掉组织表面水分，促使组织块贴壁不容易脱落；步骤3.3、将贴好华通胶组织快的T75cm2培养瓶从培养箱中取出，在生物安全柜内用10ml一次性血清移液管配上电动移液器吸取步骤3.1中配置的完全培养基，加液量10ml/T75cm2培养瓶盖好瓶盖，轻轻放入37℃5.0％CO2培养箱中培养；步骤3.4、每隔2-3天，对贴壁培养的培养瓶进行一次半换液或全换液，待贴壁华通胶组织块原代间充质干细胞生长密度达到85％以上，对原代间充质干细胞进行收集传代扩增培养，轻轻拍培养瓶是贴壁的组织块脱落，将培养瓶中的培养基和悬浮组织块收集到50ml无菌离心管中备用；再培养瓶中加入适量的0.9％生理盐水清洗贴壁的原代细胞，重复2遍，加入1ml0.125％胰酶消化2分钟，加入新鲜完全培养基中和，收集于新的50ml离心管用0.9％生理盐水稀释至50ml,离心1200rpm,5min弃上清，加完全培养基重悬按比例传代扩增培养；步骤3.5、华通胶重复贴壁培养间充质干细胞原代细胞：将步骤3.4离心管中第一次贴壁原代细胞传代处理后的组织块，加入0.9％生理盐水反复清洗2遍，将组织块残余的培养液洗净，用70um或100um细胞筛滤干水分，以备进行再次贴壁；步骤3.6、将步骤3.5中处理后的组织块，按照步骤3.2-3.5的要求重复操作，如此使每根脐带组织贴壁培养至少3-5次，即每根脐带在不同的培养阶段收获至少3-5批次的原代间充质干细胞。可选地，所述步骤3.1中的配置间充质干细胞完全培养基具体为：将500mlLONZA无血清培养基、10mlPall血清替代物和5ml100XL-谷氨酰胺充分混合均匀，100X即每100ml培养基只需加1mlL-谷氨酰胺，制备得到间充质干细胞完全培养基。可选地，所述Pall血清替代物经过0.2um针孔式滤器过滤。与现有技术相比，本专利技术可以获得包括以下技术效果：1)本专利技术通过分离方法，探索一种高效连续，能够利用宝贵而有限的脐带组织，最大限度的提高脐带组织利用率以及间充质干细胞获得率、纯化率的同时，缩短间充质干细胞获得周期的方法和路径。2)本专利技术方法采用物理分离方法预处理和反复多次贴壁法相结合，最大程度剔除脐带组织的表皮组织(外膜)及血管内皮组织(1根静脉和2根动脉)，仅保留富含间充质干细胞的华通胶组织，然后进行物理处理至2-5mm组织块贴壁加完全培养培养基37℃5.0％CO2培养箱中孵育至原代间质细胞长满后，重新收集贴壁华通胶组织块，用0.9％生理盐水清洗掉残留的培养基后再次贴壁培养，如此反复3-5次贴壁培养。相比传统方法组织贴壁一次就不再利用，本专利技术方法同数量的脐带组织，间充质干细胞的获得率提高了3-5倍。3)由于经过物理分离方法将华通胶组织外的成分最大程度的剔除，避免了表皮细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞等杂细胞大量生长，极大提高了间充质干细胞的纯化率，同时每重复贴壁一次，原代细胞长出达到传代密度的周期呈明显递减缩，表明本专利技术具有缩短间充质干细胞获得周期的优势。4)本专利技术方法中脐带组织的处理，全过程不涉及任何组织消化酶的使用，在保证脐带间充质干细胞获得周期短的同时，有效的避免了消化酶对原代细胞的生长抑制作用和消化酶对原代间充质干细胞的裂解影响。当然，实施本专利技术的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。附图说明此处所说明的附图用来提供对本专利技术的进一步理解，构成本专利技术的一部分，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种从脐带组织中分离间充质干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1、脐带采集与运输；步骤2、脐带组织的预处理；步骤3、对脐带华通胶组织块进行贴壁培养。

【技术特征摘要】
1.一种从脐带组织中分离间充质干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1、脐带采集与运输；步骤2、脐带组织的预处理；步骤3、对脐带华通胶组织块进行贴壁培养。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1中的脐带采集与运输具体为：按照无菌操作要求采集脐带，符合脐带供者采集标准，长度不小于15厘米，保持完整，无针眼及破损，尽量避免脐带与其他物品接触，浸入采集瓶的保存液中，密封标注，4°低温转运箱尽快送往实验室，整个过程不超过12小时。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2中的脐带组织的预处理具体为：步骤2.1、提前半小时将生物安全柜开机，窗口调至工作位置等待绿色LED“稳定气流”亮起，将脐带用止血钳从采集瓶中无菌取出，放入生物安全柜操作台内准备好的玻璃皿中，75％酒精浸没处理2分钟；步骤2.2、用止血钳夹出脐带转移入新的皿中，0.9％生理盐水浸没清洗一遍，并用手术剪将脐带组织剪成2cm长组织块，用敷料镊挤出组织块中残留血液；步骤2.3、用0.9％生理盐水反复清洗组织块，2-3次，直到浸没组织的生理盐水澄清透明；步骤2.4、用2把组织镊将组织块的表皮组织和血管内皮组织剔除干净，保留华通胶组织，放入无菌的新皿中；直至所有的组织块处理完毕，用医用手术剪，将收集的华通胶组织剪碎成2-5mm的华通胶块，以备贴壁培养。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3中的对脐带华通胶组织块进行贴壁培养具体为：步骤3.1、配置间充质干细胞完全培养基；步骤3.2、准备用于步骤2.4收集待贴壁华通胶组织块的T75cm2培养瓶，将华通胶组织块按间隔1-2cm间距贴在T75cm2培养瓶底面，放入37℃5.0％CO2培养箱中孵育30分钟蒸发掉组织表面水分，促使组织块贴壁不容易脱落；步骤3.3、将贴好华...

【专利技术属性】
技术研发人员：谭汝福，
申请(专利权)人：成都汇欣生命科技有限公司，
类型：发明
国别省市：四川,51