一种蝴蝶兰冰冻切片处理方法技术

本申请植物组织解剖技术领域，具体涉及一种蝴蝶兰冰冻切片处理方法。该方法包括包括组织采样、组织预处理、液氮快速冷冻、冷台固定、冰冻切片、展片、染色、观察和拍照等操作步骤。初步应用效果表明，利用本申请所提供冷冻切片方法进行实际操作时，可获得组织显微结构较完整的切片，并可获得较清晰的蝴蝶兰叶、根、花器官等组织切片图，从而为蝴蝶兰组织结构的观察和研究、以及原位杂交及亚细胞定位等分子技术的应用奠定基础。本申请相关预处理方式的改进，较好降低了冷冻处理过程中植物组织冰晶产生几率。本申请也为其他兰科植物组织的冷冻切片处理方法提供了较好借鉴和参考。

【技术实现步骤摘要】
一种蝴蝶兰冰冻切片处理方法
本申请植物组织解剖
，具体涉及一种蝴蝶兰冰冻切片处理方法。
技术介绍
蝴蝶兰（Phalaenopsis）为兰科蝴蝶兰属，单子叶植物，其叶片较大、稍肉质，腹面近墨绿色。具有圆润粗大的根，其较粗的根既有吸收环境中营养和水分的作用，还能进行生长和光合作用。蝴蝶兰茎很短，常被叶鞘所包，称为假鳞茎。花序侧生于茎的基部，花序柄绿色，常具数朵由基部向顶部逐朵开放的花。花苞片卵状三角形，长3-5毫米。中萼片近椭圆形，长2.5-3厘米，宽1.4-1.7厘米，先端钝，基部稍收狭，具网状脉。侧萼片歪卵形，先端钝，基部收狭并贴生在蕊柱足上，具网状。花瓣菱状圆形，长2.7-3.4厘米，宽2.4-3.8厘米，先端圆形，基部收狭呈短爪，具网状脉。唇瓣3裂，基部具爪，侧裂片直立，倒卵形，先端圆形或尖锐，基部收狭，具红色斑点或细条纹，在两侧裂片之间和中裂片基部相交处具一枚黄色肉突。中裂片似菱形，先端渐狭且具有卷须，基部契形。蕊柱粗壮，长约1厘米，具有宽的蕊柱足，花粉团2个，近球形，雌雄同株，花期4-6月。对蝴蝶兰的形态解剖研究表明，其叶脉为平行脉序，维管束与上、下表皮之间发育成厚壁细胞，这些厚壁组织构成机械组织。其根的基本结构包括表皮、皮层、中柱三部分；表皮为多层，构成根被；紧挨根被的是外皮层，由排列紧密的薄壁细胞组成；表皮脱落后，外皮层栓质化起保护作用；往内是中皮层，由排列疏松的皮层薄壁细胞组成的；紧挨内皮层细胞的是一层似“马蹄形’的凯氏带，有少数通道细胞细胞壁的木质化不加厚，进行皮层和维管柱之间的物质交换和信息交流。冰冻切片技术是一种将生物组织在低温下迅速冷冻达到一定硬度再进行切片的一种实验技术。该技术虽然是研究生物组织结构的一种常用技术，但由于该技术在操作过程中的冷冻要求，使得该技术并非适用于所有植物组织材料，其主要原因在于植物细胞具有细胞壁和液泡，含有大量的水分，低温速冻处理过程中这些水分容易生成冰晶并进而发生细胞破裂等结构性破坏，进而使得切片易碎，想获得较完整的切片非常困难。而随着植物冷冻处理技术的进步，使得冷冻切片技术在植物组织结构研究、分析中的应用也取得了一定进展。而就蝴蝶兰的组织结构研究而言，由于蝴蝶兰生长环境的高温、高湿特性要求，使得蝴蝶兰组织细胞中含水率普遍偏高，因此也使得冷冻切片技术是否适用于蝴蝶兰的组织结构分析是存在较大不确定性的，也是需要慎重进行研究和分析的。
技术实现思路
本申请以蝴蝶兰为例，目的在于提供一种适合兰科植物组织的冰冻切片处理方法，从而为冷冻切片技术在兰科植物组织结构分析中的应用奠定基础。本申请所采取的技术方案详述如下。一种蝴蝶兰冰冻切片处理方法，该方法具体包括如下处理步骤：（1）待处理组织取样，并进行预处理对目标组织进行取样，并进行整形处理，切成合适尺寸小块；所述目标组织具体例如为蝴蝶兰新鲜幼苗期（一年生）的叶片或气生根，或者生长良好盛花期的花柄、花萼、唇瓣或合蕊柱等组织，具体整形处理方式为：将样品洗净擦干后，用锋利的刀片将气生跟组织迅速切成1cm的小段，将叶片组织切成0.2cm×1cm的小块；将花柄修整成长1cm、横切，将花萼修整成长1cm×宽0.5cm、纵切，将唇瓣修整成长0.8cm×宽0.5cm、纵切，将合蕊柱横切修整；对整形处理后组织样品，利用含蔗糖保护液进行预处理，以降低后续冷冻过程中植物组织产生结晶的几率；所述含蔗糖保护液中，蔗糖浓度为4~16%；具体预处理方式为：将蝴蝶兰叶片组织样品置于蔗糖-PBS保护液（蔗糖浓度优选为16%）中处理20~40min（优选处理30min），然后抽真空（至无气泡冒出为止），将所得材料再用含有相同蔗糖浓度的磷酸缓冲液（浓度0.2M，缓冲液pH7.4）浸洗处理（浸洗2~4次，每次3~8min），浸洗结束后抽真空以去除浸洗液；将气生根组织样品置于蔗糖-PBS保护液（蔗糖浓度优选为4%）中处理20~40min（优选处理30min），然后抽真空（至无气泡冒出为止），将所得材料再用含有相同蔗糖浓度的磷酸缓冲液（浓度0.2M，缓冲液pH7.4）浸洗处理（浸洗2~4次，每次3~8min），浸洗结束后抽真空以去除浸洗液；将花器官组织（花柄、花萼、唇瓣、合蕊柱）样品置于蔗糖-PBS保护液，（花柄、唇瓣优选采用4%蔗糖浓度，花萼优选采用8%蔗糖浓度，合蕊柱优选采用16%蔗糖浓度）中处理30~60min（优选处理60min），然后抽真空（至无气泡冒出为止），将所得材料再用含有相同蔗糖浓度的磷酸缓冲液（浓度0.2M，缓冲液pH7.4）浸洗处理（浸洗2~4次，每次3~8min）；（2）冷冻处理，并进行包埋处理将步骤（1）中蔗糖-PBS处理后组织样品置于液氮中，液氮速冻20~30s；然后，在-15~-25℃条件下（优选-20℃），利用OCT或普通胶水包埋15~30min（优选20min）；（3）冷冻切片将步骤（2）中包埋处理样品切片操作时，叶片组织切片厚度为10~20μm（优选15μm），气生根组织切片厚度为10~20μm（优选20μm）；花柄组织切片厚度为10~20μm（优选15μm）；花萼组织切片厚度为10~20μm（优选10μm）；唇瓣组织切片厚度为10~20μm（优选20μm）；花柱组织切片厚度为10~20μm（优选10μm）；为便于后续研究、观察，可进一步对步骤（3）中冷冻切片进行展片、染色及拍照操作，具体而言：打开放卷板，对步骤（3）中的切片进行展片，观察组织的超微结构；染色操作时，直接对切片进行番红单染色、固绿单染色或者番红-固绿双重染色；叶片组织、气生根组织、合蕊柱，优选采用番红-固绿双重染色；花柄、花萼、唇瓣优选采用番红单染色；所述番红-固绿双重染色（番红-固绿复染）（常温下染色），具体方法是：向展开的材料用质量分数1%的番红水溶液染色15~30min（叶片组织和气生根组织优选25min，合蕊柱组织优选为15min），用蒸馏水洗涤4次，再用质量分数为0.1%的固绿染色20s，用质量分数为95%的乙醇或蒸馏水冲洗固绿至材料不褪色为止，之后在材料表面上滴加质量分数为50%的甘油，盖上盖玻片；番红单染色时，染色处理时间优选为20min；染色结束后，观察蝴蝶兰组织冷冻切片的显微结构，并拍照保存。本申请属于一种蔗糖保护-液氮冷冻的冰冻切片法，利用本申请所提供的蝴蝶兰冷冻切片处理方法对组织显微结构进行研究时，包括组织采样、组织预处理、液氮快速冷冻、冷台固定、冰冻切片、展片、染色、观察和拍照等操作步骤。初步应用效果表明，利用本申请所提供冷冻切片方法进行实际操作时，可获得组织显微结构较完整的切片，并可获得较清晰的蝴蝶兰叶、根、花器官等组织切片图，从而为蝴蝶兰组织结构的观察和研究、以及原位杂交及亚细胞定位等分子技术的应用奠定基础。总体而言，本申请中，专利技术人以蝴蝶兰幼嫩叶、根以及花器官为例，对冷冻切片技术中的预处理、冷台固定、冷冻切片等关键性操作参数进行了优化，建立了一种适用于蝴蝶兰组织显微结构观察和研究的冷冻切片方法。尤其是相关预处理方式的改进，较好降低了冷冻处理过程中植物组织冰晶产生几率，从而为后续冷冻切片奠定了良好基础。另一方面，在本申请所提供冷冻切片处理方法基础上，也为其他兰科植物组织的冷冻切片处理方法提供了较好借鉴和参考。因此本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种蝴蝶兰冰冻切片处理方法，其特征在于，该方法包括如下处理步骤：（1）待处理组织取样，并进行预处理对目标组织进行取样，并进行整形处理，切成合适尺寸小块；所述目标组织具体为蝴蝶兰幼苗期的叶片或气生根，或者生长良好盛花期的花柄、花萼、唇瓣或合蕊柱组织；对整形处理后组织样品，利用含蔗糖保护液进行预处理；所述含蔗糖保护液中，蔗糖浓度为4~16%；具体预处理方式为：将蝴蝶兰叶片组织样品置于蔗糖‑PBS保护液中处理20~40min，然后将所得材料再用含有相同蔗糖浓度的磷酸缓冲液浸洗处理；将气生根组织样品置于蔗糖‑PBS保护液中处理20~40min，然后将所得材料再用含有相同蔗糖浓度的磷酸缓冲液浸洗处理；将花器官组织中的花柄、花萼、唇瓣或合蕊柱样品置于蔗糖‑PBS保护液中处理30~60min，将所得材料再用含有相同蔗糖浓度的磷酸缓冲液浸洗处理；（2）冷冻处理，并进行包埋处理将步骤（1）中蔗糖处理后组织样品置于液氮中，液氮速冻20~30s；然后，在‑15 ~ ‑25℃条件下，包埋15~30min；（3）冷冻切片将步骤（2）中包埋处理样品切片操作时，各组织切片厚度均为10~20μm。

【技术特征摘要】
1.一种蝴蝶兰冰冻切片处理方法，其特征在于，该方法包括如下处理步骤：（1）待处理组织取样，并进行预处理对目标组织进行取样，并进行整形处理，切成合适尺寸小块；所述目标组织具体为蝴蝶兰幼苗期的叶片或气生根，或者生长良好盛花期的花柄、花萼、唇瓣或合蕊柱组织；对整形处理后组织样品，利用含蔗糖保护液进行预处理；所述含蔗糖保护液中，蔗糖浓度为4~16%；具体预处理方式为：将蝴蝶兰叶片组织样品置于蔗糖-PBS保护液中处理20~40min，然后将所得材料再用含有相同蔗糖浓度的磷酸缓冲液浸洗处理；将气生根组织样品置于蔗糖-PBS保护液中处理20~40min，然后将所得材料再用含有相同蔗糖浓度的磷酸缓冲液浸洗处理；将花器官组织中的花柄、花萼、唇瓣或合蕊柱样品置于蔗糖-PBS保护液中处理30~60min，将所得材料再用含有相同蔗糖浓度的磷酸缓冲液浸洗处理；（2）冷冻处理，并进行包埋处理将步骤（1）中蔗糖处理后组织样品置于液氮中，液氮速冻20~30s；然后，在-15~-25℃条件下，包埋15~30min；（3）冷冻切片将步骤（2）中包埋处理样品切片操作时，各组织切片厚度均为10~20μm。2.如权利要求1所述蝴蝶兰冰冻切片处理方法，其特征在于，对步骤（3）中冷冻切片进行展片、染色及拍照操作，具体而言：打开放卷板，对步骤（3）中的切片进行展片，然后进行染色；染色操作时，对切片进行番红单染色、固绿单染色或者番红-固绿双重染色；染色结束后，观察蝴蝶兰组织冷冻切片的显微结构，并拍照保存。3.如权利要求2所述蝴蝶兰冰冻切片处理方法，其特征在于，叶片组织、气生根组织、合蕊柱采用番红-固绿双重染色；花柄、花萼、唇瓣采用番红单染...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋素华，许申平，梁芳，张燕，袁秀云，李艳辉，王默霏，周一冉，马杰，崔波，
申请(专利权)人：郑州师范学院，
类型：发明
国别省市：河南,41