一种用于池塘废水处理的生物膜厌氧反硝化强化碳源筛选方法技术

本发明专利技术公开了一种用于池塘废水处理的生物膜厌氧反硝化强化碳源筛选方法，包括以下步骤：(1)生物膜厌氧微生物的分离与培养；(2)厌氧微生物悬液的制备；(3)厌氧微生物代谢特征的测定；(4)厌氧微生物碳源利用率的测定与分析。本发明专利技术通过Biolog‑ECO生态板对厌氧微生物所需碳源进行筛选，检验快速省时，并且实验结果准确可靠、针对性强。利用本发明专利技术建立的方法筛选出的碳源对养殖废水的脱氮效果要明显高于常规方法筛选的碳源效果。

【技术实现步骤摘要】
一种用于池塘废水处理的生物膜厌氧反硝化强化碳源筛选方法
本专利技术属于水产养殖废水处理领域，涉及一种生物膜厌氧反硝化强化碳源的筛选方法，具体涉及一种用于池塘废水处理的生物膜厌氧反硝化强化碳源筛选方法。
技术介绍
近年来，水产养殖尤其是池塘养殖已成为人们获取优质动物蛋白的重要生产方式，仅中国就有256.69万公顷的池塘养殖面积。然而，随着集约化养殖程度不断加大，养殖密度不断提高，高密度、高投入的养殖模式导致池塘氮、磷污染严重，给水环境造成巨大的污染压力。在目前水资源短缺和养殖需水量持续增加的双重压力下，迫切需要对水产养殖废水进行有效修复和再利用，营造稳定、可控的健康养殖环境。研究表明生物膜能有效促进氮、磷循环。生物膜在自然界中无处不在，几乎有水(海洋、河流、湖泊等)的地方都有生物膜的存在。生物膜的密度沿深度方向不断增大，溶氧呈梯度式降低，生物膜内部溶氧的梯度变化形成生物膜的好氧层和厌氧层，其中好氧层更适合好氧微生物生存，厌氧层更适合厌氧微生物生存，这种内外层微生物的分化形成了生物膜独特的微观生态位。生物膜微生物在这种溶氧梯度分布环境下可同时实现好氧硝化和厌氧反硝化两个反应，其中好氧层进行有机物的降解和硝化反应，将NH4+转化为NO2-和NO3-，厌氧层进行反硝化反应将好氧层产生的NO2-和NO3-以及扩散到厌氧层的有机物转化为N2，从而实现生物膜同步硝化反硝化脱氮过程。生物膜法因具有生态友好、运行成本低、性能稳定、操作简单等众多优点而备受关注，在水处理与环境水体原位修复方面得到大量应用。然而，生物膜法在实际应用中存在电子供体供应不足的缺点，导致挂膜启动时间长，启动阶段水处理效率低下，污染物去除率提升慢，已成为养殖系统中生物膜应用的制约环节。有效地提供给生物膜足够的电子供体是提高生物膜脱氮效率的核心途径，有研究表明，合适的碳源作为生物膜微生物的营养和脱氮反硝化的电子供体，能加速生物膜挂膜启动，并有效提高生物膜的反硝化脱氮效率。但是，目前生物膜脱氮反应中实现微生物脱氮所需碳源的研究中，大部分仅集中在生物膜上所有附着微生物对碳源利用情况，并没有把生物膜厌氧反硝化过程的厌氧微生物所需碳源进行筛选，虽然已有一些研究者通过试验的方式筛选了一些碳源，对生物膜的脱氮挂膜启动起到了一定的促进作用，但这些碳源筛选盲目性大，未能从生物膜的厌氧微生物反硝化需求本身出发进行研究。只有提高生物膜厌氧反硝化过程中对有效电子供体的供应，才能真正地加速生物膜的脱氮速率，起到事半功倍的效果。因此，进行池塘养殖系统中生物膜厌氧微生物的碳源筛选，以及生物膜厌氧微生物所需碳源匹配图谱的构建是本领域亟需解决的问题。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了一种用于池塘废水处理的生物膜厌氧反硝化强化碳源筛选方法，目的在于针对性地强化生物膜的厌氧反硝化速率，更好地强化生物膜脱氮能力，实现养殖废水的高效处理。为了实现上述目的，本专利技术提供了一种用于池塘废水处理的生物膜厌氧反硝化强化碳源筛选方法，包括以下步骤：(1)生物膜厌氧微生物的分离与培养：将厌氧微生物从生物膜上分离到生理盐水培养液中获得含有厌氧微生物的培养液；(2)厌氧微生物悬液的制备：将(1)中厌氧微生物培养液与生理盐水混合得到厌氧微生物悬液；(3)厌氧微生物代谢特征的测定：将(2)中制备好的厌氧微生物悬液滴加到Biolog-ECO生态板上并培养；(4)厌氧微生物碳源利用率的测定与分析：将(3)中的Biolog-ECO生态板在酶标仪上进行检测，选择代谢强的碳源作为生物膜厌氧反硝化强化碳源。本专利技术的有益效果为：1.与以往的研究(水体、生物膜上微生物代谢特征)不同的是，其他微生物代谢特征测定都是在有氧环境下进行的，而本方法是在厌氧环境下针对性地得到了厌氧微生物的代谢特征，这个代谢特征可以用于厌氧微生物反硝化碳源的筛选，更精准地衡量厌氧微生物的脱氮需求。2.本专利技术可避免筛选生物膜脱氮强化碳源时的盲目性，从生物膜厌氧微生物需求出发，针对性地利用碳源图谱去筛选生物膜厌氧微生物反硝化所需碳源，可避免盲目筛选出的碳源导致生物膜二次水污染的不良后果，本专利技术针对性地提供了一种用于池塘废水处理的生物膜厌氧微生物所需碳源的筛选方法，根据此方法筛选出的反硝化强化碳源可以达到强化生物膜脱氮的目的。进一步，步骤(1)中，上述生物膜厌氧微生物的分离与培养方法为：培养池塘养殖废水处理系统中的生物膜，在无菌条件下将生物膜样品放入生理盐水中，厌氧培养后，充分震荡，将生物膜上固着的厌氧微生物分离到生理盐水培养液中，即得到分离好的厌氧微生物培养液。作为优选，上述生物膜在池塘养殖废水处理系统中培养时间为15-30天；上述生物膜样品定量称取3g；上述生理盐水为150mL灭菌的生理盐水，质量分数为0.9％，其中预先充纯氮气使其保持厌氧环境；上述厌氧培养时间为2h以上。上述进一步的有益效果在于，生理盐水中预先充纯氮气使其保持厌氧环境，给厌氧微生物提供了合适的生存环境，避免影响其生物特征。进一步，步骤(2)中，上述厌氧微生物悬液的制备方法为：将步骤(1)中分离好的厌氧微生物培养液转移至厌氧培养箱中，并与灭菌生理盐水混合均匀，即得到厌氧微生物悬液。作为优选，上述厌氧微生物培养液与灭菌生理盐水的质量比为1:3-4。上述进一步的有益效果在于，厌氧微生物悬液的制备过程是在厌氧培养箱中进行的，保持了操作过程的厌氧环境。进一步，步骤(3)中，上述厌氧微生物代谢特征的测定的方法为：将步骤(2)中制作好的厌氧微生物悬液滴加到Biolog-ECO生态板上，完成后将Biolog-ECO生态板进行培养。其中，Biolog-ECO生态板为美国BIOLOG公司独家研发的产品ECO板，特别为微生物群落分析和生态研究设计，Eco板上包含国际土壤微生物学家精选的用于微生物群落分析最常用的31种碳源，是国际上微生物生态功能多样性研究的最典型和最权威方法之一。Biolog-ECO生态板每块96孔，ECO板上有3组平行，每组31种碳源，3个阴性对照，加入同一样品后，可以获得3组平行数据。微生物群落对这31种碳源的特征性利用称作该微生物群落的代谢指纹图谱，从单个的微平板上的指纹图谱就可以获得大量的代谢信息，可用于纯种及混合菌群(如土壤样品)微生物功能多样性研究。作为优选，上述培养条件为25-28℃的厌氧条件，上述培养时间为48h；上述厌氧微生物悬液的滴加和Biolog-ECO生态板的培养过程全程在厌氧环境的厌氧培养箱进行。上述进一步的有益效果在于，通过Biolog-ECO生态板对厌氧微生物所需碳源进行筛选，Biolog-Eco生态板上碳源丰富，并有平行和对照试验，检验快速省时，并且实验结果准确可靠、针对性强。进一步，步骤(4)中，上述厌氧微生物碳源利用率的测定与分析方法为：步骤(3)中的Biolog-ECO生态板培养完成后，将其从厌氧培养箱中快速取出，并立即在酶标仪上进行检测，对光密度值读数进行记录，之后将测定的吸光值进行平均颜色变化率计算，得到每类碳源的平均颜色变化率，选择代谢强的碳源作为生物膜厌氧反硝化强化碳源。作为优选，上述检测波长为590nm。作为优选，选择平均颜色变化率在1.2-2.5之间的碳源作为生物膜厌氧反硝化强化碳源。上述进一步的有益效果在于，通过每类碳源的平均颜色变本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于池塘废水处理的生物膜厌氧反硝化强化碳源筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)生物膜厌氧微生物的分离与培养：将厌氧微生物从生物膜上分离到生理盐水培养液中获得含有厌氧微生物的培养液；(2)厌氧微生物悬液的制备：将(1)中厌氧微生物培养液与生理盐水混合得到厌氧微生物悬液；(3)厌氧微生物代谢特征的测定：将(2)中制备好的厌氧微生物悬液滴加到Biolog‑ECO生态板上并培养；(4)厌氧微生物碳源利用率的测定与分析：将(3)中的Biolog‑ECO生态板在酶标仪上进行检测，选择代谢强的碳源作为生物膜厌氧反硝化强化碳源。

【技术特征摘要】
1.一种用于池塘废水处理的生物膜厌氧反硝化强化碳源筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)生物膜厌氧微生物的分离与培养：将厌氧微生物从生物膜上分离到生理盐水培养液中获得含有厌氧微生物的培养液；(2)厌氧微生物悬液的制备：将(1)中厌氧微生物培养液与生理盐水混合得到厌氧微生物悬液；(3)厌氧微生物代谢特征的测定：将(2)中制备好的厌氧微生物悬液滴加到Biolog-ECO生态板上并培养；(4)厌氧微生物碳源利用率的测定与分析：将(3)中的Biolog-ECO生态板在酶标仪上进行检测，选择代谢强的碳源作为生物膜厌氧反硝化强化碳源。2.根据权利要求1所述的一种用于池塘废水处理的生物膜厌氧反硝化强化碳源筛选方法，其特征在于，步骤(1)所述生物膜厌氧微生物的分离与培养方法为：培养池塘养殖废水处理系统中的生物膜，在无菌条件下将生物膜样品放入生理盐水中，厌氧培养后，充分震荡，将生物膜上固着的厌氧微生物分离到生理盐水培养液中，即得到分离好的厌氧微生物培养液。3.根据权利要求2所述的一种用于池塘废水处理的生物膜厌氧反硝化强化碳源筛选方法，其特征在于，所述生物膜在池塘养殖废水处理系统中培养时间为15-30天；所述生物膜样品定量称取3g；所述生理盐水为150mL灭菌的生理盐水，质量分数为0.9％，其中预先充纯氮气使其保持厌氧环境。4.根据权利要求1所述的一种用于池塘废水处理的生物膜厌氧反硝化强化碳源筛选方法，其特征在于，步骤(2)所述厌氧微生物悬液的制备方法为：将步骤(1)中分离好的厌氧微生物培养液转移至厌氧培养箱中，并与灭菌生理盐水混合均匀，即得...

【专利技术属性】
技术研发人员：李志斐，谢骏，王广军，李家磊，张凯，龚望宝，余德光，郁二蒙，田晶晶，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院珠江水产研究所，
类型：发明
国别省市：广东,44