一种地克珠利半抗原、人工抗原及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种地克珠利半抗原、人工抗原及其制备方法与应用。本发明专利技术所提供的地克珠利人工抗原为将式I所示的地克珠利半抗原与载体蛋白偶联所得的抗原。本发明专利技术所提供地克珠利人工抗原合成方法简单，纯度高和产率高，对于地克珠利抗体的制备，以及地克珠利药物残留检测具有重大价值。

A Diclozuril hapten and artificial antigen and its preparation method and Application

The invention discloses diclazuril hapten, artificial antigen, preparation method and application thereof. The diclazuril artificial antigen provided by the invention is an antigen obtained by coupling diclazuril hapten shown in formula I with carrier protein. The synthetic method of diclazuril artificial antigen provided by the invention is simple, high purity and high yield, and has great value for the preparation of diclazuril antibody and the detection of diclazuril drug residues.

【技术实现步骤摘要】
一种地克珠利半抗原、人工抗原及其制备方法与应用
本专利技术属于药物残留快速检测领域，涉及一种地克珠利人工抗原及其制备方法与应用。
技术介绍
在集约化的养殖模式中，球虫是最常见的流行暴发性寄生虫疾病，具有高度的易感性，而且死亡率较高，一旦发生往往对养殖者造成极严重的经济损失。球虫作为一种寄生虫，使用疫苗进行免疫难以产生良好的免疫效果，而且代价昂贵，所以长期药物预防一直是畜禽球虫病防治的唯一可靠手段。20世纪80年代出现的均三嗪类抗球虫药因其高效、广谱、毒性低，在畜牧业生产中受到了广泛的重视。地克珠利（diclazuril）又名氯嗪苯乙氰，属三嗪苯乙腈化合物，属于高效、低毒的新型抗球虫药，被广泛应用于治疗和预防禽类及哺乳动物的球虫感染。对球虫主要作用峰期，随球虫的不同种属而异。地克珠利的排泄速度很慢，大部分以原药形式排出。尽管地克珠利具有低毒性的特点，但很容易产生耐药性，随着使用剂量的逐渐增加，在禽类动物源食品中的残留量也有增加的趋势。食品添加剂联合专家委员会(JECFA)和欧盟药品管理局(EuropeanMedicinesAgency)都分别对地克珠利的毒理学研究数据进行了评估，并推荐了日允许摄入量(Ac-ceptableDailyIntakes)和最高残留限量MRLs。农业部第2002-235号公告也对地克珠利的MRLs进行了规定。地克珠利在畜禽生产中的广泛应用，使得建立一种高效灵敏的均三嗪类药物残留分析方法成为日益迫切的需要。目前对于地克珠利的检测方法，主要有高效液相法和液质联用法，虽然这些方法特异性强、灵敏度高，但是操作繁琐、仪器昂贵，不适用于大批量样品的筛选检测。免疫化学分析法在抗原抗体的定性定量方面具有独特的优势，其操作简便快速、成本低、灵敏度较高、分析样本量大，弥补了理化分析的不足。影响免疫化学分析质量的根本因素是抗体的特异性与亲和性，这些性质又决定于免疫半抗原分子的结构，因此免疫半抗原的分子设计与合成是产生特异性抗体和建立小分子兽药残留快速检测技术的最基础、最关键的步骤。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种地克珠利人工抗原及其制备方法与应用。本专利技术所提供的地克珠利人工抗原是在地克珠利半抗原的基础上构建所得的抗原。所述地克珠利半抗原属于本专利技术的保护范围，其结构如式I所示。式I本专利技术所提供的制备所述地克珠利半抗原的方法，具体可包括如下步骤：1、重氮化溶液的制备：纯水混合浓盐酸，加入对氨基苯甲酸，搅拌，冰浴条件下加入亚硝酸钠溶液，所述纯水、浓盐酸、对氨基苯甲酸的配比为4mL：515μl：336mg，所述亚硝酸钠溶液为203mg亚硝酸钠溶解于5mL纯水中，所述反应时间为1h；2、纯水中加入地克珠利原料药搅拌，呈白色浊液，冰浴下加入步骤1中的重氮化溶液，体系为黄色浊液溶液，4℃反应过夜。所述纯水、地克珠利原料药的配比为5mL：1000mg。将溶剂旋干，残余物柱层析纯化，得到地克珠利半抗原（式I）652mg。在地克珠利半抗原的基础上构建所得的地克珠利抗原也属于本专利技术的保护范围。所述地克珠利抗原，为将所述地克珠利半抗原（式I）与载体蛋白偶联所得的抗原。在本专利技术的一个实施例中，所述载体蛋白具体为牛血清白蛋白（BSA）或卵清蛋白（OVA）。所述地克珠利抗原的制备方法也属于本专利技术的保护范围。所述地克珠利抗原的制备方法，具体可包括如下步骤：将所述地克珠利半抗原（式I）与载体蛋白通过酰胺键偶联，获得所述地克珠利抗原。其中，所述地克珠利半抗原（式I）与所述载体蛋白偶联的摩尔比为19.5：1。在本专利技术中，所述地克珠利抗原具体是按照包括如下步骤的方法制备获得的：（1）将所述地克珠利半抗原（式I）溶解于二甲基甲酰胺（DMF）中，然后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），20-25℃磁力搅拌反应2-3h，得到溶液I；其中，所述地克珠利半抗原（式I）、所述二甲基甲酰胺（DMF）、所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）、所述N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）的配比为24.88mg：1.5mL：21.5mg：13mg。（2）将所述载体蛋白置于0.1M碳酸氢钠缓冲液中，200rpm搅拌10min，充分溶解，得到溶液II；所述载体蛋白与所述0.1M碳酸氢钠缓冲液的配比为33.6-50mg：3.5mL；其中，若所述载体蛋白为牛血清白蛋白（BSA），则所述牛血清白蛋白（BSA）与所述0.1M碳酸氢钠缓冲液的配比为50mg：3.5mL；若所述载体蛋白为卵清蛋白（OVA），则所述卵清蛋白（OVA）与所述0.1M碳酸缓冲液的配比为33.6mg：3.5mL；（3）将所述溶液I和所述溶液II混合，具体为在0-4℃条件下，1000rpm搅拌下，将溶液I逐滴加入到所述溶液II中，500rpm搅拌反应24h，得到溶液III；（4）用磷酸盐缓冲液（0.01MPBS，pH7.2），于4℃对所述溶液III搅拌透析3天，得到所述地克珠利抗原。所述地克珠利半抗原（式I）或所述地克珠利抗原在定性或定量检测地克珠利中的应用也属于本专利技术的保护范围。利用所述地克珠利抗原制备的抗体也属于本专利技术的保护范围。所述抗体可为多克隆抗体、单克隆抗体或抗血清。本专利技术所提供的地克珠利半抗原，以及所述地克珠利抗原，合成方法简单、纯度高、产率高，对于地克珠利抗体的制备，以及地克珠利药物残留检测具有重大价值。附图说明图1为地克珠利半抗原质谱图。图2为BSA的MALDI-TOF-MAS图。图3为地克珠利BSA复合物的MALDI-TOF-MAS图。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。地克珠利：上海安谱实验科技股份有限公司产品，其产品编号CDCT-C12533000。实施例1、地克珠利半抗原的制备一、地克珠利半抗原的制备50mL圆底烧瓶中加入4mL纯水，515μl浓盐酸，加入对氨基苯甲酸336mg，室温搅拌使体系搅拌均匀，冰浴下加入亚硝酸钠溶液（203mg亚硝酸钠溶解于5mL纯水中），冰浴下反应1h。50mL圆底烧瓶中加入5mL纯水，加入地克珠利1000mg，室温搅拌使体系搅拌均匀，呈白色浊液，冰浴下加入上述重氮化溶液，体系为黄色浊液溶液，4℃反应过夜。将体系溶剂旋干，残余物柱层析纯化，得到地克珠利半抗原652mg。反应方程式如下：二、地克珠利半抗原的结构鉴定对所得652mg地克珠利半抗原进行质谱检测（图1），结果显示其化学结构式如式I所示（MW=555.76），即为地克珠利半抗原。式I实施例2、地克珠利人工抗原的制备及结构鉴定一、地克珠利人工抗原的制备1、免疫原的合成（1）将24.88mg地克珠利半抗原用1.5mLDMF溶解，200rpm搅拌10min，加入EDC21.5mg溶解后再加入NHS13mg，室温搅拌（500rpm）活化2-3h。（2）称取BSA50mg溶于3.5mL0.1M碳酸氢钠溶液中，200rpm搅拌10min，使其充分溶解，冰浴降温0-4℃，1000rpm搅拌下，将步骤1反应液逐滴加入（1mL/min），500rpm搅拌反应24h.（3）将反应产物装入蒸馏水冲洗干净透析袋（10cm），1L0.01MP本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种化合物，其结构如式I所示：

【技术特征摘要】
1.一种化合物，其结构如式I所示：式I。2.制备权利要求1所述化合物的方法，包括步骤为：（1）重氮化溶液的制备：纯水混合浓盐酸，加入对氨基苯甲酸，搅拌，冰浴条件下加入亚硝酸钠溶液，所述纯水、浓盐酸、对氨基苯甲酸的配比为4-5mL：500-520μl：335-340mg，所述亚硝酸钠溶液为200-210mg亚硝酸钠溶解于5mL纯水中，所述反应时间为1h；（2）纯水中加入地克珠利原料药搅拌，呈白色浊液，冰浴下加入步骤（1）中的重氮化溶液，体系为黄色浊液溶液，4℃反应过夜；所述纯水、地克珠利原料药的配比为5mL：1000mg；将溶剂旋干，残余物柱层析纯化，得到地克珠利半抗原（式I）652mg。3.地克珠利抗原，为将权利要求1所述化合物与载体蛋白偶联所得的抗原。4.根据权利要求3所述的地克珠利抗原，其特征在于：所述载体蛋白可以是牛血清白蛋白、卵清蛋白、人血清白蛋白、血蓝蛋白、鼠血清蛋白、甲状腺蛋白或兔血清蛋白。5.权利要求3或4所述的地克珠利抗原的制备方法，包括如下步骤：将权利要求1所述化合物与载体蛋白通过酰胺键偶联，获得所述地克珠利抗原；权利要求1所述化合物与所述载体蛋白偶联的摩尔比为19.5：1。6.根据权利要求5所述的地克珠利抗原的制备方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：（1）将所述地克珠利半抗原（式I）溶解于二甲基甲酰胺（DMF）中，然后加入1-(3-二甲氨基丙基...

【专利技术属性】
技术研发人员：聂靖东，邢维维，刘薇，贾良曦，王照鹏，
申请(专利权)人：北京维德维康生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11