一种与辣椒滞绿基因连锁的分子标记及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种与辣椒滞绿基因连锁的分子标记及应用。利用2份高度纯合的材料构建了F2群体。利用BSR群体定位的方法获得与辣椒果实棕色(滞绿基因)紧密连锁的染色体区域，并在候选区间内开发分子标记确定候选基因。根据候选基因的单碱基突变设计了1个KASP分子标记，利用该标记对F2群体90个单株进行基因型鉴定，符合率达到100％。研究结果不仅有助于辣椒果实颜色鉴别及辅助育种，且为滞绿基因的图位克隆及解析滞绿的分子机理提供了基础，具有广泛的推广价值。

A Molecular Marker Linked to the Stagnation Green Gene in Pepper and Its Application

The invention discloses a molecular marker linked with the green-retarding gene of capsicum and its application. Two highly homozygous materials were used to construct F2 population. The chromosome regions closely linked to the brown (stagnant green) gene of pepper fruit were obtained by BSR population mapping method, and molecular markers were developed to identify candidate genes in the candidate regions. A KASP molecular marker was designed according to the single base mutation of candidate genes. The genotype of 90 individual plants in F2 population was identified by this marker, and the coincidence rate was 100%. The results not only contribute to color identification and assistant breeding of pepper fruits, but also provide a basis for map cloning and analysis of molecular mechanism of stagnant green genes, which is of wide popularization value.

【技术实现步骤摘要】
一种与辣椒滞绿基因连锁的分子标记及应用
本专利技术属于辣椒育种和分子生物学领域，涉及一种与辣椒(CapsicumannuumL)滞绿基因连锁的分子标记及该分子标记在辣椒果实颜色鉴定和育种中的应用。
技术介绍
辣椒，拉丁文名：CapsicumannuumL.，茄科、辣椒属一年或有限多年生草本植物。辣椒属主要包括5个栽培品种：C.annuumL、C.frutescensL、C.baccacumL、C.pubescensKeep、C.chineseJacquin。辣椒原产于中拉丁美洲热带地区，原产国是墨西哥。在中国主要分布在四川、贵州、湖南、云南、陕西、河南(淅川县)、河北省鸡泽县和内蒙古托克托县。据农业部大宗蔬菜体系统计，我国辣椒栽培面积不断增加，辣椒产业取得了巨大的进步，近年来我国辣椒年播种面积在150万～200万hm2，目前已经占全国蔬菜总播种面积的8％～10％。在我国的一部分地区，人民日常饮食中已经离不开辣椒。辣椒作为一种重要的蔬菜，其营养价值丰富，在世界各地广泛种植，且在我国成为种植面积最大的蔬菜。辣椒果实颜色丰富，在青果期，类胡萝卜素含量较低，叶绿素作为主要的色素决定着辣椒果实颜色。辣椒未成熟果有深绿、浅绿、黄绿、乳白色、紫色、黑色等多种颜色。但随着果实的发育，果实中叶绿体和白色体分化为有色体，造成类胡萝卜素的积累果实颜色转变为黄色，橙色或者红色。但是在辣椒中存在一种滞绿突变体，果实成熟期抑制叶绿素的降解，导致成熟果实中仍然包含大量的叶绿素致使果实颜色为棕色或绿色。根据滞绿突变体叶片发育过程中叶绿素含量和光合速率的变化，将滞绿突变体划分为：非功能性滞绿突变体和功能性滞绿突变体。功能性滞绿突变体相比野生型其衰老起始时间延迟或衰老进程减缓，而在非功能性滞绿突变体其衰老过程中光合能力的下降速率与野生型相同，但叶绿素降解受到显著延缓。功能型滞绿突变体在功能型滞绿基因的作用下减缓或阻止了茎、叶、果实中叶绿素的降解，致使滞绿型品种在成熟后茎、叶、果实中的叶绿素含量始终保持原水平而不减少，同时也保持了光合作用，这就有可能使滞绿突变体的生物学产量要比非滞绿的同物种高。从另一个角度讲滞绿基因也是与衰老有关的基因，对它的深入研究可能是解决农作物早衰的新途径。相对于功能型滞绿突变体而言，非功能型滞绿突变体很可能是叶绿素降解通路本身的缺陷，造成突变体叶绿素的滞留。通过解析非功能性滞绿突变体有利于从遗传学角度阐明叶绿素降解途径。在植物的生理成熟时期及其后期，有滞绿性状的植株很容易辨识。这一非常直观的外在表型可以作为良种繁育和杂交育种的筛选标记。滞绿突变体在观赏类的植物选育和栽培中，也有很大的潜力。黑暗处理后叶片仍然保持绿色，其观赏价值不因长时间黑暗储藏和运输而降低。绿色蔬菜在贮存、运输或加工过程中，叶绿素容易降解，叶片发黄变质，难以适应远途运输和较长时间的贮藏，使其食用品质和商品品质下降。因此延缓绿色蔬菜叶片衰老、变质、延长保鲜期、提高其经济价值、成为一个迫切需要解决的难题。在实际生产上，虽然保持蔬菜绿色的方法有很多，但有的方法成本太高，有的方法在加工过程中由于重金属的残留而受到食品卫生法的限制，并且保绿效果不十分理想。滞绿突变体具有在衰老后叶绿素降解不明显和叶片依然保持绿色的先天优势，因而在绿叶蔬菜的育种和栽培上有巨大的应用前景和经济价值。因此辣椒滞绿突变体作为一种重要的种质资源，将会深受未来育种家们的青睐。通过开发与辣椒滞绿基因连锁的分子标记，采用杂交和回交等技术快速的将滞绿基因与其他优良性状基因导入到植株中，为选育高质量的新品种提供基因资源。开发与滞绿基因连锁的分子标记，有利于辣椒果实颜色的选育，且为克隆滞绿基因，研究叶绿素降解的分子机制奠定了基础。
技术实现思路
本专利技术的首要目的在于针对辣椒果实中出现的滞绿现象，提供一种与辣椒滞绿基因连锁的分子标记SGR。为辣椒滞绿突变体的筛选，鉴定和辅助筛选辣椒果实的颜色，以及辣椒果实颜色的育种等提供新的途径。一种与辣椒滞绿基因连锁的分子标记，为辣椒LOC107866321基因编码区下游342bp处G向A的突变，所述的辣椒LOC107866321基因的序列如SEQIDNO.1所示。进一步的，所述的分子标记对应的基因型：A:A为具有滞绿表型的基因型、G:G和A:G为不具有滞绿表型的基因型。进一步的，针对辣椒LOC107866321基因突变设计的引物如下：反向引物SGR-1：GATGAAGTGGTTGCAGAATG，序列如SEQIDNO.2所示；正向引物SGR-2：TGACATCTTCCCTTTAACTTTCTTC，序列如SEQIDNO.3所示；正向引物SGR-3：TGACATCTTCCCTTTAACTTTCTTT，序列如SEQIDNO.4所示。进一步的，两个正向引物分别连接不同的荧光接头序列。进一步的：荧光接头序列为FAM或HEX(LGC公司合成)，优选：连接了荧光接头序列的正向引物SGR-2：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGACATCTTCCCTTTAACTTTCTTC，序列如SEQIDNO.5所示；连接了荧光接头序列的正向引物SGR-3：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGACATCTTCCCTTTAACTTTCTTT，序列如SEQIDNO.6所示。本专利技术的第二个目的是提供上述分子标记的应用，有利于辣椒果实颜色的选育，且为克隆滞绿基因，研究叶绿素降解的分子机制奠定基础。具体如下：所述的分子标记用于鉴定和辅助筛选辣椒果实的颜色。进一步的，所述的分子标记用于辣椒果实颜色育种。进一步的，所述的分子标记应用时，采用PCR反应进行检测。进一步的，所述的分子标记应用时，具体包括以下步骤：(1)以待测样品基因组DNA为模板，利用分子标记的扩增引物进行Touchdo-wnPCR扩增，获得扩增产物；(2)对扩增产物进行荧光检测与分析。进一步的，对扩增产物进行荧光检测时，如果样品PCR产物只检测到连接了荧光接头序列的引物SGR-3对应的荧光信号，则检测位点为A:A基因型，判定为果实颜色为具有滞绿表型的棕色单株；如果样品PCR产物只检测到连接了荧光接头序列的引物SGR-2对应的荧光信号，则检测位点为G:G基因型，判定为果实颜色为不具有滞绿表型的红色单株；若同时检测到连接了荧光接头序列的引物SGR-2和SGR-3对应的两种荧光信号，则检测位点为A:G基因型，判定为果实颜色为不具有滞绿表型的红色单株。进一步的，所述的分子标记应用时，采用TouchdownPCR。进一步的，TouchdownPCR扩增程序为：94℃15min；95℃20s；65℃-56℃60s，10个循环，每个循环退火延伸温度降0.8℃；94℃20s；57℃60s，26个循环。本专利技术利用BSR定位的方法，定位到一个控制辣椒成熟果实颜色的滞绿蛋白基因(SGR)，并依据该基因的突变位点，开发了与该辣椒滞绿蛋白基因相关联的KASP分子标记。可以直接用于辣椒果实颜色表型和对应基因型的鉴定，进而依赖该分子标记进行辅助育种，能够有效的解决常规育种周期长，易受到环境影响的问题。通过早期利用该分子标记可以快速筛选到满意的植株，有效的减小了种植规模，减少了后期鉴定的工作量。提高了选择的效率和准确性。对研究果实颜色的形成机制具有重本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种与辣椒滞绿基因连锁的分子标记，为辣椒LOC107866321基因编码区下游342bp处G向A的突变，所述的辣椒LOC107866321基因的序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种与辣椒滞绿基因连锁的分子标记，为辣椒LOC107866321基因编码区下游342bp处G向A的突变，所述的辣椒LOC107866321基因的序列如SEQIDNO.1所示。2.根据权利要求1所述的分子标记，其特征在于，所述的分子标记对应的基因型：A:A为具有滞绿表型的基因型、G:G和A:G为不具有滞绿表型的基因型。3.根据权利要求1所述的分子标记，其特征在于，针对辣椒LOC107866321基因突变设计的引物如下：反向引物SGR-1：GATGAAGTGGTTGCAGAATG，序列如SEQIDNO.2所示；正向引物SGR-2：TGACATCTTCCCTTTAACTTTCTTC，序列如SEQIDNO.3所示；正向引物SGR-3：TGACATCTTCCCTTTAACTTTCTTT；序列如SEQIDNO.4所示。4.根据权利要求3所述的分子标记，其特征在于，两个正向引物分别连接不同的荧光接头序列。5.根据权利要求4所述的分子标记，其特征在于：荧光接头序列为FAM或HEX，连接了荧光接头序列的正向引物SGR-2优选：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGACATCTTCCCTTTAACTTTCTTC，序列如SEQIDNO.5所示；连接...

【专利技术属性】
技术研发人员：欧立军，刘宇华，杨博智，陈文超，张竹青，周书栋，杨莎，李雪峰，马艳青，戴雄泽，邹学校，
申请(专利权)人：湖南省蔬菜研究所，
类型：发明
国别省市：湖南,43