与油菜多分枝性状主效QTL位点连锁的SNP分子标记及应用制造技术

本发明专利技术公开了与油菜多分枝性状主效QTL位点紧密连锁的SNP分子标记及其应用，与位于A04染色体上的主效QTL位点连锁的SNP分子标记BN‑1，在该染色体第16318236位碱基呈现多态性，其碱基为A或G，与位于A10染色体上的主效QTL位点连锁的SNP分子标记BN‑2，在该染色体第17187477位碱基呈现多态性，其碱基为T或G。通过这两个分子标记可以预测油菜的分枝数目，应用于油菜分枝性状的早期鉴定和筛选。

【技术实现步骤摘要】
与油菜多分枝性状主效QTL位点连锁的SNP分子标记及应用
本专利技术属于分子生物学及遗传育种
，具体涉及与油菜多分枝性状主效QTL位点紧密连锁的分子标记及其在油菜多分枝育种中的应用。
技术介绍
油菜是我们重要的油料作物之一。油菜的产量受其株型结构和环境因素影响，而一次分枝数与产量直接正相关。我国油菜种植面积和产量均居世界第一，然而单产低于加拿大、澳大利亚等国家。因此，增加一次分枝数是增加油菜单产的有效途径之一。分子标记辅助选择育种，可以减少盲目性，缩短育种年限，大大提高选择效率。分子标记辅助选择育种技术的关键是与重要农艺性状紧密连锁的DNA分子标记的鉴定。目前，常用于辅助育种的分子标记有简单序列重复(simplesequencerepeats,SSR)标记，插入/缺失多态性(Insertion/Deletion，InDel)标记和单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism,SNP)标记。这三种标记具有共显性、重复性好和多态性丰富等优点。SNP标记通过对目标区段的同源序列测序，根据同一位点核苷酸的多态性设计，具有操作简单、结果稳定等优点。申请人利用自然群体中一次分枝数表型差异的2个亲本构建F2群体，利用简化基因组重测序构建遗传图谱，共检测到2个主效QTL位点，利用重测序数据开发出了2个SNP标记，并在后代群体中进行了验证。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供了2个与油菜多分枝性状主效QTL位点紧密连锁的SNP分子标记，与主效QTL位点Chr.A04-BN-1紧密连锁的SNP分子标记为BN-1，SNP位点为第16318236位碱基，其碱基为A或G；与主效QTL位点Chr.A10-BN-2紧密连锁的SNP分子标记为BN-2，SNP位点为第17187477位碱基，其碱基为T或G。本专利技术的另外一个目的是提供了一种油菜多分枝性状的连锁标记在油菜分枝性状育种中的应用。此类标记不仅可用于辅助选择育种，也可为今后分枝数主效基因的克隆提供基础。为了实现上述的目的，本专利技术采用以下技术措施：油菜多分枝性状主效QTL位点的发掘方法，它包括如下步骤：a)利用油菜分枝数差异组合5L795(15分枝)和5L796(4分枝)进行杂交，F1代自交产生F2代分离群体；b)提取亲本5L795和5L796、F1代及F2代分离群体的叶片总DNA；c)利用GENOSEQ公司的简化基因组测序平台对油菜两亲本及F2分离群体DNA样品进行分型，在亲本中筛选到有多态性的SNP位点后，获得多态性SNP位点在F2群体中的分布；d)通过在F2代分离群体中SNP位点的分布进行数据分析，根据连锁交换规律，利用群体基因型资料构建油菜的遗传图谱，所用软件为Joinmap3.0，最小LOD值设为2.5，获得连锁图谱(图1)；将双亲本及F2群体的198个单株的分枝数数据及多态性的分布情况输入计算机，运行WinQTLcart4.0软件对数据进行关联性分析，单向方差分析测得与多分枝性状相关的概率P值和位点对多分枝性状的贡献率，检测到2个与分枝数相关的主效QTL位点，并得到与其紧密连锁的2个SNP标记。主效QTL位点Chr.A04-BN-1位于第A04染色体，连锁标记为BN-1，该分子标记在该染色体第16318236位碱基处呈现多态性，其碱基为A或G。主效QTL位点Chr.A04-BN-2位于第A10染色体，连锁标记为BN-2，该分子标记在该染色体第17187477位碱基处呈现多态性，其碱基为T或G。与油菜多分枝性状主效QTL位点紧密连锁的SNP分子标记在油菜分枝数育种中的应用：检测上述SNP位点的类型，分子标记BN-1的SNP位点的等位基因均为A，则极有可能表现为多分枝，SNP位点的等位基因均为G，则大概率表现为少分枝；分子标记BN-2的SNP位点等位基因均为T，则极有可能表现为多分枝，SNP位点等位基因均为G，则大概率表现为少分枝。进一步地，可利用SNP位点差异及基因组序列开发SNP标记引物及探针，直接实时定量PCR扩增后经软件分析进行基因分型，引物及探针如下：分子标记BN-1的扩增引物为：BN-1F：AAAGCTGACCGTTGACCAAABN-1R：TAAAGCCTGTCCGGTCCCAABN-1probe：5'FAM-CCAAAGACGGAACTCAAGCCCATGAA/G-BEHQ3'分子标记BN-1的扩增引物为：BN-2F：CATAGCTGAAGAAGTCGGCATBN-2R：TGAGCTCTCAGGCCATATCTBN-2probe：5'FAM-ACATTGGCTCCATGT/GTGCAATGCAGA-BEHQ3'。本专利技术的优点在于：首次定位了油菜品系5L795中的两个多分枝性状主效QTL位点，并开发出与其分别连锁的SNP分子标记。通过检测分枝数主效QTL位点，可以在苗期进行淘汰，不仅节约生产成本而且大大提高选择效率。本专利技术中多分枝主效QTL位点位置明确，主效QTL位点的检测方便快速，不受环境影响。通过检测与分枝数性状相关的分子标记，即可以预测分枝数的数目，进而可以快速筛选多分枝株系用于油菜株型育种，辅助育种选择目标明确，节约成本。附图说明图1为位于A04和A10染色体上控制分枝数的主效QTL位点的连锁图谱。图2为分子标记BN-1和BN-2在F2代株系中的鉴定筛选结果。具体实施方式实施例1：油菜多分枝性状主效QTL位点的开发(1)构建分枝数极端差异油菜品系组合5L795/5L796F2分离群体利用油菜分枝数差异组合5L795(15分枝)和5L796(4分枝)进行杂交，F1代自交产生F2代分离群体；成熟期分别统计双亲本、F1和F2代分离群体中的分枝数目。(2)提取亲本、F1及F2分离群体叶片总DNA利用CTAB法提取叶片总DNA，具体步骤如下：A.适量叶片样品取自超低温冰箱(-70℃)，立即放入冰冻过的研钵中，加入液氮研磨成粉状；快速装入50ml离心管中，加入在60℃的水浴锅中预热过的提取液(0.2MTris－Cl，0.25NaCl，25mMEDTA，0.5％(质量比)SDS，pH7.5)，混合均匀，放入60℃的水浴锅中水浴40min；B.取出离心管，加入等体积氯仿：异戊醇(24：1，V/V)，缓慢上下颠倒离心管30-50次，使充分混匀，1300g离心10分钟；C.取上清于另一离心管中，加入等体积氯仿：异戊醇(24：1，V/V)，重新抽提一次；取上清加入0.6倍体积冰冷异戊醇，缓慢颠倒离心管，直至有絮状沉淀集结为止；静止30min，挑出沉淀，70％(体积比)酒精洗2-3次，无水乙醇洗一次，干燥后加无菌水65℃20min溶解；D.再次加入等体积氯仿：异戊醇(24：1，V/V)，重新抽提；取上清，加入0.1倍NaAc(3mol/L，PH5.2)，混匀后缓慢加入2倍体积的冰无水乙醇，静止5min后缓慢转动离心管直至絮状沉淀出现，挑出沉淀转入1.5ml离心管中，70％(体积比)酒精洗2-3次，无水乙醇洗一次，干燥后加无菌水溶解，于-20℃冰箱中保存备用。(3)简化基因组测序及连锁分析利用GENOSEQ公司的简化基因组测序平台对油菜两亲本及F2分离群体DNA样品进行重测序，在亲本中筛选到有多态性的SNP位点后，分析多态性SNP位点在本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.与油菜多分枝性状主效QTL位点紧密连锁的SNP分子标记，其特征在于，与位于A04染色体上的主效QTL位点连锁的SNP分子标记BN‑1，在该染色体第16318236位碱基呈现多态性，其碱基为A或G；与位于A10染色体上的主效QTL位点连锁的SNP分子标记BN‑2，在该染色体第17187477位碱基呈现多态性，其碱基为T或G。

【技术特征摘要】
1.与油菜多分枝性状主效QTL位点紧密连锁的SNP分子标记，其特征在于，与位于A04染色体上的主效QTL位点连锁的SNP分子标记BN-1，在该染色体第16318236位碱基呈现多态性，其碱基为A或G；与位于A10染色体上的主效QTL位点连锁的SNP分子标记BN-2，在该染色体第17187477位碱基呈现多态性，其碱基为T或G。2.根据权利要求1所述的与油菜多分枝性状主效QTL位点紧密连锁的SNP分子标记，其特征在于，所述分子标记BN-1包含SEQIDNO.1-2所示的核苷酸序列，所述分子标记BN-2包含SEQIDNO.3-4所示的核苷酸序列。3.可识别或扩增权利要求1或2所述SNP分子标记的引物对或分子探针。4.根据权利要求2...

【专利技术属性】
技术研发人员：王汉中，华玮，郑明，王新发，张亮，刘红芳，
申请(专利权)人：中国农业科学院油料作物研究所，
类型：发明
国别省市：湖北,42