一种检测槟榔细菌性叶斑病菌的方法技术

本发明专利技术公开了一种检测槟榔细菌性叶斑病菌的方法，该方法包括对被检样品进行预处理，提取被检样品的DNA；采用特异引物Ba‑F/Ba‑R进行PCR反应；电泳检测，判断结果。本发明专利技术的检测槟榔细菌性叶斑病菌的方法克服了常规检测方法的不足，具有高特异性、反应稳定的优点，同时准确率高，易操作，用时短，全程检测只需4‑6h。

【技术实现步骤摘要】
一种检测槟榔细菌性叶斑病菌的方法
本专利技术属于分子生物学技术检测细菌领域，尤其涉及一种检测槟榔细菌性叶斑病菌的方法。
技术介绍
槟榔(ArecacathecuL.)，棕榈科槟榔属多年生常绿乔木，茎直立，乔木状，高10多米，最高可达30米，原产于热带太平洋地区、东南亚、南亚和东非部分地区，是我国重要的南药资源之一。中国槟榔主产区在海南和台湾，其中海南槟榔总产量位居世界第二位，且单位产量同样位居世界第二，达3336kg/hm2。槟榔是海南第一大经济作物，海南农民种植槟榔是脱贫致富的途径之一。然而，随着槟榔种植面积的不断扩大，新的病害也不断出现。自1985年起，海南岛不少槟榔园先后发生不同程度的槟榔细菌性叶斑病，该病害严重影响槟榔的生长和产量。槟榔细菌性叶斑病是由须芒草伯克霍尔德氏菌(Burkholderiaandropogonis)侵染引起。该病可以侵染各龄槟榔叶，形成褐色坏死病斑，病斑周围有黄色晕圈，病斑不规则形，严重者导致整片叶片黄化干枯。带病种苗、田间病株及其残体是该病害的主要侵染来源，其通过雨水、流水和露水传播，从植株自然孔口和伤口入侵。雨量大、湿度高时，病害发展快，病情重。台风时雨水传播病菌，且植株伤口增多，利于病菌入侵，病害易流行。目前的生产上，迫切需要能在早期诊断该病害的快速检测技术，但至今尚未见相关报道。因此，建立一套槟榔细菌性叶斑病病原菌快速、稳定的检测方法，是槟榔产区安全生产的重要保证。
技术实现思路
鉴于现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种检测槟榔细菌性叶斑病菌的方法，旨在解决常规检测方法耗时、准确度偏低的问题。为了实现本专利技术的目的，专利技术人通过大量试验研究并不懈努力，最终获得了如下技术方案：一种检测槟榔细菌性叶斑病菌的方法，该方法包括：步骤一、对被检样品进行预处理，提取被检样品的总DNA；步骤二、采用特异引物Ba-F/Ba-R进行PCR反应，其中上游引物Ba-F的序列如SEQIDNO：1所示，下游引物Ba-R的序列如SEQIDNO：1所示；步骤三、电泳检测，按如下标准判断检测结果：有大小为513bp的特异亮带，表示结果为阳性；若无带，表示结果为阴性。进一步优选地，如上所述的检测槟榔细菌性叶斑病菌的方法，其中的PCR反应体系具体如下：2×TransTaq-TPCRSuperMix10μl，上下游引物Ba-F和Ba-R各1μl，DNA模板1μl，无菌ddH2O7μl，设置阳性对照反应时，用槟榔细菌性叶斑病菌基因组总DNA为模版；设置阴性对照反应时，用无菌ddH2O代替。进一步优选地，如上所述的检测槟榔细菌性叶斑病菌的方法，其中的上游引物Ba-F和下游引物Ba-R浓度均为10μmol/L。进一步优选地，如上所述的检测槟榔细菌性叶斑病菌的方法，其中的PCR反应条件具体如下：反应在Biometra050-901PCR仪上进行，95℃预变性3min；95℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延长40sec，进行40个循环；72℃延长10min。进一步优选地，如上所述的检测槟榔细菌性叶斑病菌的方法，其中PCR反应结束后，取5μL反应产物，2％琼脂糖凝胶电泳后Goldview染色观察结果。本专利技术以须芒草伯克霍尔德氏菌基因组中的保守的16SribosomalRNA的部分序列，比较分析该序列与槟榔细菌性条斑病菌、大肠杆菌等细菌16SribosomalRNA中的差异位点，并考虑引物长度、GC含量、错配率、是否形成引物二聚体、3’端有无连续碱基等因素，设计了一对高特异性、反应稳定的引物，用于从槟榔叶片上特异性地检测须芒草伯克霍尔德氏菌。因此，本专利技术还提供了一种适用于检测不同发病程度的槟榔细菌性叶斑病的特异引物对，该引物对的上游引物Ba-F的序列如SEQIDNO：1所示，下游引物Ba-R的序列如SEQIDNO：1所示。另一方面，本专利技术还提供了上述特异引物对在检测田间不同发病程度的槟榔细菌性叶斑病中的应用。最后一方面，本专利技术还提供了一种适用于检测田间不同发病程度的槟榔细菌性叶斑病的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括以下成分：2×TransTaq-TPCRSuperMix10μl，上下游引物Ba-F和Ba-R各1μl，DNA模板1μl，无菌ddH2O7μl；设置阳性对照反应时，用槟榔细菌性叶斑病菌基因组总DNA为模版；设置阴性对照反应时，用无菌ddH2O代替。与现有技术相比，本专利技术检测槟榔细菌性叶斑病菌的方法克服了常规检测方法的不足，具有高特异性、反应稳定的优点，同时准确率高，易操作，用时短，全程检测只需4-6h。附图说明图1是本专利技术实施例提供的检测槟榔细菌性叶斑病菌的方法流程图；图2是本专利技术实施例提供的槟榔细菌性叶斑病菌检测引物的特异性分析结果；图3是本专利技术实施例提供的槟榔细菌性叶斑病菌检测的田间应用检测结果。具体实施方式为能进一步了解本专利技术的
技术实现思路
、特点及功效，兹例举以下实施例，并配合附图详细说明如下。以下实施例仅是对本专利技术的较佳实施例而已，并非对本专利技术保护范围作任何形式上的限制，凡是依据本专利技术的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本专利技术技术方案的范围内。实施例一：槟榔细菌性叶斑病菌的检测检测槟榔细菌性叶斑病菌的方法流程图如图1所示，具体检测步骤包括：S101、对被检样品进行预处理，提取被检样品的DNA；具体操作是，将被检测槟榔样品用清水洗净擦干，在病健交界处切取组织块，再按照TIANGEN公司的细菌基因组DNA提取试剂盒(DP302)说明书提取待检测槟榔样品的DNA。S102、根据多种序列比对，设计特异引物Ba-F/Ba-R，序列如下：Ba-F：5′-ACCTCGCGCTATAGGGGCG-3′；Ba-R：5′-CATCGATGTTCCTCCGCATA-3′。采用Ba-F和Ba-R引物做PCR反应；PCR反应具体如下：20μL反应体系：2×TransTaq-TPCRSuperMix10μl，上下游引物Ba-F和Ba-R各1μl，上下游引物引物浓度均为10μmol/L，DNA模板1μl，无菌ddH2O7μl，设置阳性对照反应时，用槟榔细菌性叶斑病菌基因组总DNA为模版；设置阴性对照反应时，用无菌ddH2O代替；反应在Biometra050-901PCR仪上进行，95℃预变性3min；95℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延长40sec，进行40个循环；72℃延长10min。S103、电泳检测，判断结果。PCR反应结束后，取5μL反应产物，2％琼脂糖凝胶电泳后Goldview染色观察结果。判断标准：如果用Ba-F和Ba-R引物做PCR检测，有大小为513bp的特异亮带，表示结果为阳性，若无带，表示结果为阴性。实施例二：检测方法的特异性、灵敏性和田间应用分析PCR检测的特异性分析：以须芒草伯克霍尔德氏菌(Burkholderiaandropogonis)，以及槟榔细菌性条斑病菌(Xanthomonascampestrispv.arecae)、槟榔炭疽病菌(Colletotrichumgloeoporioides)、槟榔茎基腐病(Ganodernalucidum)、槟榔芽腐病菌(Phythophthorameadii)和槟榔茎泻血病菌(Thielaviops本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测槟榔细菌性叶斑病菌的方法，其特征在于，该方法包括：步骤一、对被检样品进行预处理，提取被检样品的总DNA；步骤二、采用特异引物Ba‑F/Ba‑R进行PCR反应，其中上游引物Ba‑F的序列如SEQ ID NO：1所示，下游引物Ba‑R的序列如SEQ ID NO：1所示；步骤三、电泳检测，按如下标准判断检测结果：有大小为513bp的特异亮带，表示结果为阳性；若无带，表示结果为阴性。

【技术特征摘要】
1.一种检测槟榔细菌性叶斑病菌的方法，其特征在于，该方法包括：步骤一、对被检样品进行预处理，提取被检样品的总DNA；步骤二、采用特异引物Ba-F/Ba-R进行PCR反应，其中上游引物Ba-F的序列如SEQIDNO：1所示，下游引物Ba-R的序列如SEQIDNO：1所示；步骤三、电泳检测，按如下标准判断检测结果：有大小为513bp的特异亮带，表示结果为阳性；若无带，表示结果为阴性。2.根据权利要求1所述的检测槟榔细菌性叶斑病菌的方法，其特征在于，所述的PCR反应体系具体如下：2×TransTaq-TPCRSuperMix10μl，上下游引物Ba-F和Ba-R各1μl，DNA模板1μl，无菌ddH2O7μl，设置阳性对照反应时，用槟榔细菌性叶斑病菌基因组总DNA为模版；设置阴性对照反应时，用无菌ddH2O代替。3.根据权利要求2所述的检测槟榔细菌性叶斑病菌的方法，其特征在于，所述的上游引物Ba-F和下游引物Ba-R浓度均为10μmol/L。4.根据权利要求1所述的检测槟榔细菌性叶斑病菌的方法，其特征在于，所述的PCR反应条件...

【专利技术属性】
技术研发人员：施海涛，韦运谢，刘国银，方娇，
申请(专利权)人：海南大学，
类型：发明
国别省市：海南,46