一种检测恶性高热易感基因的多重检测试剂盒及其用途制造技术

本发明专利技术涉及一种多重基因检测试剂盒。具体而言，本发明专利技术涉及检测恶性高热易感性单核苷酸多态性(SNP)的引物组合物、多重基因检测试剂盒及其用途。本发明专利技术采用两管以上多重PCR结合片段长短/质量分析方法，同步快速定性检测与恶性高热易感性相关的37个SNP位点。试剂盒组成：用于扩增所述37个SNP位点及内参的4管引物组合物、PCR反应液、4管阳性对照液和无核酸酶水。试剂盒使用方法：(1)采集样本提取核酸，或采集口腔脱落细胞于细胞采集卡上；(2)采用步骤1所述细胞采集卡或提取的核酸为模板进行多重PCR扩增；(3)按PCR产物片段长短/质量同步分离37个SNP位点；(4)结果分析判读。

A Multiplex Detection Kit for Detecting Malignant Hyperthermia Susceptibility Genes and Its Application

The invention relates to a multiple gene detection kit. Specifically, the invention relates to a primer composition for detecting malignant high fever susceptibility single nucleotide polymorphism (SNP), a multiplex gene detection kit and its use. The invention adopts two or more tubes of multiplex PCR combined with length/quality analysis method to simultaneously and rapidly detect 37 SNP loci related to malignant high fever susceptibility. Composition of kit: 4-tube primer composition, PCR reaction solution, 4-tube positive control solution and non-nuclease water for amplification of 37 SNP loci and internal reference. Methods of using the kit: (1) collecting samples to extract nucleic acid, or collecting oral exfoliated cells on the cell acquisition card; (2) multiplex PCR amplification using the cell acquisition card mentioned in step 1 or the extracted nucleic acid as template; (3) isolating 37 SNP sites synchronously according to the length/quality of the product fragment; (4) result analysis and interpretation.

【技术实现步骤摘要】
一种检测恶性高热易感基因的多重检测试剂盒及其用途
本专利技术涉及一种多重基因检测试剂盒。具体而言，本专利技术涉及检测恶性高热易感性单核苷酸多态性(SNP)的引物组合物、多重基因检测试剂盒及其用途。
技术介绍
恶性高热(MalignantHyperthermia,MH)是目前所知的唯一可由常规麻醉用药引起手术死亡的遗传性疾病。在全麻过程中，挥发性吸入麻醉药和去极化肌松药-琥珀胆碱可引起骨骼肌异常高代谢状态，患者出现高热、酸中毒、低氧血症、高血钾、心律失常等一系列变化，一旦发病，病情发展迅速，在没有特效拮抗药丹曲林的情况下，一般临床措施难以控制病情，最终病人可因器官功能衰竭而死亡。恶性高热在普通人群中的发病率为1/10000-1/250000。由于临床上遇到恶性高热，往往都没有做好预防措施，治疗不及时，致死率高达70％-90％。若患者及时接受治疗并使用特效药丹曲林，致死率可降低到10％以内。MH作为一种常染色体显性遗传病，研究证实至少有5个基因的异常与其发生有关，但已明确的致病基因仅为罗纳丹受体(Ryanodinereceptor,RYR1)和编码二氢吡啶受体α1亚单位的CACNA1S(Ltypevoltage-dependentcalciumchannel，L型电压门控Ca2+通道)。2017年8月欧洲恶性高热组织(EMHG)公布，目前已确认37个单核苷酸多态性(SNP)可以作为恶性高热易感性的判断依据，包括RYR1的35个单核苷酸多态性和CACNA1S的2种单核苷酸多态性。因此，对于采用全麻麻醉的手术患者，术前筛查恶性高热易感性，可帮助医生调整麻醉方案，有效避免恶性高热发生。目前，国际上公认咖啡因-氟烷体外肌挛缩试验(CHCT)是确诊MH易感性的金标准。然而CHCT价格昂贵，局限于专业测试中心使用，需要外科手术切取患者一块肌肉，创伤性较大，且不容易区分假阳性和假阴性结果，在某种程度上限制了其广泛应用。而通过检测与恶性高热相关的SNP位点来判断恶性高热易感性，操作方便，成本较低，是一种可行性较高的检测方案。现有的SNP位点检测方法主要有三种：荧光定量PCR、基因芯片技术、测序法。荧光定量PCR采用荧光淬灭及双末端标记技术，针对SNP位点设计特异性的探针。其优点是灵敏度高、准确性强。其缺点在于：通量低，如同时检测37个SNP位点，需要一个一个位点检测，耗时长，样品用量大，难以适应临床需求；难以设置内参质控，无法避免假阳性和假阴性；探针标记成本高。基因芯片是通过微加工技术，将数以万计乃至百万计的特定序列的DNA片段(基因探针)有规律地排列固定于硅片、玻片等支持物上构成的一个二维DNA探针阵列，利用这类芯片与标记的生物样品进行杂交，从而对样品的基因表达谱生物信息进行快速定性和定量分析。其优点是通量高、操作简便；缺点是检测成本昂贵、重复性差、灵敏度较低。此外，芯片的种类较多，难以制定一个统一的质量控制标准，这也限制了基因芯片技术的普及。Sanger测序法是SNP分型金标准，不仅能发现已知SNP，也能发现未知SNP。但Sanger测序法操作复杂、成本较高、周期长，需要一个一个位点进行测序，多个SNP位点测序耗时长、累计价格相对昂贵。二代测序技术实现了边合成边测序，具有高通量、高效率的优势。然而二代测序平台价格昂贵、普及度低，作为SNP检测技术还不够成熟。综上所述，由于恶性高热易感基因SNP数量较多，以上技术均具有明显的局限性，因此很难应用于恶性高热易感基因的检测。本领域仍需要更有效的方法来检测恶性高热易感基因SNP。
技术实现思路
本专利技术采用的SNP检测方法基于多重聚合酶链式反应(PCR)和毛细管电泳(CE)分离技术。其特征在于，采用两管以上多重PCR结合片段长短/质量分析方法，同步快速定性检测与恶性高热易感性相关的37个单核苷酸多态性(SNP)位点，如表1.1-1.4所示。表1.1A组SNP位点及引物组合物表1.2B组SNP位点及引物组合物表1.3C组SNP位点及引物组合物表1.4D组SNP位点及引物组合物因SNP位点只有1个碱基突变，本专利技术针对每一个SNP位点设计了3条引物，其中2条引物分别与野生型基因和突变型基因互补结合，1条共用的引物与另一段的野生型和突变型引物分别扩增出片段长短有2-10个碱基差异的片段。在同一个反应管中同时加入多对特异性基因扩增引物及内参引物，获得大小不一的基因扩增片段，使用毛细管电泳进行分离，进而分析SNP基因型。一方面，本专利技术提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括：用于扩增所述37个SNP位点及内参的4管引物组合物、PCR反应液、4管阳性对照液和无核酸酶水。所述试剂盒将所述37个SNP位点分成四组，并在每组中加入4个内参(3个人类基因组内参(huDNA)和1个PCR反应内参(pcDNA))，同步检测4组引物组合物，如表1.1-1.4所示。所述四组引物组合物包括：MHPrimerMixA、MHPrimerMixB、MHPrimerMixC和MHPrimerMixD，其中引物组合物MHPrimerMixA包含11个SNP位点不同基因型的正反向扩增引物SEQIDNO.1-31及4个内参的正反向扩增引物SEQIDNO.108-111、SEQIDNO.116-119；引物组合物MHPrimerMixB包含9个SNP位点不同基因型的正反向扩增引物SEQIDNO.32-56及4个内参的正反向扩增引物SEQIDNO.108-109、SEQIDNO.112-115、SEQIDNO.118-119；引物组合物MHPrimerMixC包含10个SNP位点不同基因型的正反向扩增引物SEQIDNO.57-86及4个内参的正反向扩增引物SEQIDNO.108-109、SEQIDNO.112-113、SEQIDNO.116-119；引物组合物MHPrimerMixD包含7个SNP位点不同基因型的正反向扩增引物SEQIDNO.87-107及4个内参的正反向扩增引物SEQIDNO.108-109、SEQIDNO.114-119。所述人类基因组内参(huDNA)用于监测DNA样品的质量，DNA质量不好时，可避免假阴性；PCR反应内参(pcDNA)用于监测PCR反应过程，可避免因PCR反应失败造成的假阴性及因杂峰造成的假阳性。所述试剂盒包括四组阳性对照品MHPOSA、MHPOSB、MHPOSC、MHPOSD，其中MHPOSA为A组所包含的SNP位点和内参基因所对应的质粒混合物；MHPOSB为B组所包含的SNP位点和内参基因所对应的质粒混合物；MHPOSC为C组所包含的SNP位点和内参基因所对应的质粒混合物；MHPOSD为D组所包含的SNP位点和内参基因所对应的质粒混合物。所述质粒混合物为：将包含每个SNP位点的基因片段及内参基因分别克隆到质粒载体中，再将克隆后的质粒混合而成，用于SNP检测系统测试及每次引物订购后的质量控制。本专利技术所采用的PCR反应液包括以下组分：无核酸酶水、2×PCR缓冲液、DNA聚合酶、dNTP。使用所述试剂盒来检测恶性高热易感性SNP的步骤包括：(1)采集口腔脱落细胞保存于细胞采集卡，或采集血液样本并提取核酸。其中，保存于细胞采集卡上的口腔脱落细胞，亦可不进行核酸提取，直接用于PCR扩增，节省了核酸提本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种试剂盒，所述试剂盒包括如表1.1‑1.4所示的四组引物组合物MH Primer Mix A、MH Primer Mix B、MH Primer Mix C和MH Primer Mix D，其中引物组合物MH Primer Mix A包含11个SNP位点不同基因型的正反向扩增引物SEQ ID NO.1‑31及4个内参的正反向扩增引物SEQ ID NO.108‑111、SEQ ID NO.116‑119；引物组合物MH Primer Mix B包含9个SNP位点不同基因型的正反向扩增引物SEQ ID NO.32‑56及4个内参的正反向扩增引物SEQ ID NO.108‑109、SEQ ID NO.112‑115、SEQ ID NO.118‑119；引物组合物MH Primer Mix C包含10个SNP位点不同基因型的正反向扩增引物SEQ ID NO.57‑86及4个内参的正反向扩增引物SEQ ID NO.108‑109、SEQ ID NO.112‑113、SEQ ID NO.116‑119；引物组合物MH Primer Mix D包含7个SNP位点不同基因型的正反向扩增引物SEQ ID NO.87‑107及4个内参的正反向扩增引物SEQ ID NO.108‑109、SEQ ID NO.114‑119。表1.1 A组SNP位点及引物组合物...

【技术特征摘要】
1.一种试剂盒，所述试剂盒包括如表1.1-1.4所示的四组引物组合物MHPrimerMixA、MHPrimerMixB、MHPrimerMixC和MHPrimerMixD，其中引物组合物MHPrimerMixA包含11个SNP位点不同基因型的正反向扩增引物SEQIDNO.1-31及4个内参的正反向扩增引物SEQIDNO.108-111、SEQIDNO.116-119；引物组合物MHPrimerMixB包含9个SNP位点不同基因型的正反向扩增引物SEQIDNO.32-56及4个内参的正反向扩增引物SEQIDNO.108-109、SEQIDNO.112-115、SEQIDNO.118-119；引物组合物MHPrimerMixC包含10个SNP位点不同基因型的正反向扩增引物SEQIDNO.57-86及4个内参的正反向扩增引物SEQIDNO.108-109、SEQIDNO.112-113、SEQIDNO.116-119；引物组合物MHPrimerMixD包含7个SNP位点不同基因型的正反向扩增引物SEQIDNO.87-107及4个内参的正反向...

【专利技术属性】
技术研发人员：王凡，吴勇，余丁，
申请(专利权)人：宁波海尔施基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33