一种齐多夫定的基因毒性杂质的高效液相检测方法技术

本申请公开了一种齐多夫定的基因毒性杂质的高效液相检测方法，所述方法包括：提供样品分析溶液；将样品分析溶液注入高效液相色谱仪进行色谱分析，并记录色谱图；其中色谱柱为反相色谱柱，流动相为酸铵盐溶液与有机相的混合液。通过上述方式，本申请能够提高基因毒性杂质的检测分离度和检测限度。

A High Performance Liquid Chromatographic Method for Detecting Genotoxic Impurities of Zidovudine

This application discloses a high performance liquid chromatography method for the detection of genotoxic impurities of zidovudine, which includes: providing sample analysis solution; injecting sample analysis solution into high performance liquid chromatography for chromatographic analysis and recording chromatograms; the chromatographic column is a reversed phase chromatographic column, and the mobile phase is a mixture of ammonium acid solution and organic phase. In the above way, the application can improve the detection separation degree and detection limit of genotoxic impurities.

【技术实现步骤摘要】
一种齐多夫定的基因毒性杂质的高效液相检测方法
本申请涉及药物分析
，特别是涉及一种齐多夫定的基因毒性杂质的高效液相检测方法。
技术介绍
齐多夫定，化学名为l-(3-叠氮-2,3-二脱氧-β-D-呋喃核糖基)-5-甲基嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮，其结构式为：齐多夫定，即3’-叠氮-3’-脱氧胸苷，为天然胸腺嘧啶核苷的合成类似物。是第一个上市的用于治疗获得性免疫缺陷综合症(AIDS)的新药，它通过与病毒DNA聚合酶结合，中止DNA链增长，从而抑制病毒的复制。英国葛兰素公司首先研制成功并上市，临床已广泛用于治疗HIV感染、艾滋病和重症艾滋病相关综合症。齐多夫定合成过程中生成的杂质imp2/imp3/imp4(具体结构请参阅表1)均含有磺酸酯结构，根据欧洲药品管理局于2006年6月28日颁布的《基因毒性杂质限度指南》所述，该类杂质均被认为含有警示结构，或者称为基因毒性杂质，因此需要细致而深入的研究，以确保其对产品的质量无影响。本申请的专利技术人在长期的研发过程中，发现由于基因毒性杂质限度极低，检测过程中需要极大的进样浓度，而进样浓度变大时，样品分析溶液中的产品峰不可避免地会因样品过载出现拖尾现象，而与产品极性相近的杂质的定量不可避免地会受主峰拖尾的影响，不能很好的对基因毒性杂质进行定量控制，因此亟待需要开发一种检测齐多夫定的基因毒性杂质的方法。
技术实现思路
本申请主要解决的技术问题是提供一种齐多夫定的基因毒性杂质的高效液相检测方法，能够提高检测分离度和检测限度。为解决上述技术问题，本申请采用的一个技术方案是：提供一种齐多夫定的基因毒性杂质的高效液相检测方法，所述方法包括：提供样品分析溶液；将样品分析溶液注入高效液相色谱仪进行色谱分析，并记录色谱图；其中所用色谱柱为反相色谱柱，所用流动相为酸铵盐溶液与有机相的混合液。其中，利用甲醇、乙腈、甲醇-水混合液或乙腈-水混合液对样品进行溶解，制得样品分析溶液。其中，样品为齐多夫定原料药、齐多夫定中间体或齐多夫定制剂。其中，流动相中酸铵盐溶液与有机相的混合体积比为95:5～50:50，流动相的pH值为4.0～8.0。其中，采用梯度洗脱的方式进行洗脱，其中，梯度洗脱时，在运行时间的0～10分钟范围内，流动相中酸铵溶液的体积比为90～30％，在运行时间的10～20分钟范围内，流动相中酸铵溶液的体积比为35～5％，在运行时间的20～21分钟范围内，流动相中酸铵溶液的体积比为5～90％，在运行时间的21～30分钟范围内，流动相中酸铵溶液的体积比为90～90％。其中，酸铵盐溶液的浓度为0.001～0.05mol/L，酸铵盐溶液为甲酸铵盐溶液、乙酸铵盐溶液、碳酸氢铵盐溶液中的一种或多种。其中，反相色谱柱为苯基硅烷键合硅胶色谱柱、氰基键合硅胶色谱柱、氨基键合硅胶色谱柱、十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱或八烷基硅烷键合硅胶色谱柱中的一种。其中，反相色谱柱的柱长为100mm～300mm，内径为1mm～10mm，粒径为1μm～10μm。其中，流动相的流速为0.8～1.3ml/min；色谱柱的柱温为25～50℃；检测波长为205～300nm；运行时间为40～70min。其中，基因毒性杂质的化学结构式为本申请的有益效果是：区别于现有技术的情况，本申请提供一种齐多夫定的基因毒性杂质的高效液相检测方法，通过利用反相色谱柱，并使用酸铵盐溶液与有机相的混合液进行洗脱，能够提高基因毒性杂质的检测分离度和检测限度。进一步地，本申请根据基因毒性杂质与样品的溶解性差异，改变样品分析溶液的溶剂，以增大样品分析溶液中杂质的浓度，同时降低产品的浓度；减小产品浓度过大对分离度带来的影响；同时能够有效防止色谱柱过载，提高色谱柱的使用寿命。附图说明图1是本申请齐多夫定的基因毒性杂质的高效液相检测方法第一实施方式的流程示意图；图2是本申请实验例1的检测色谱图；图3是本申请实验例2的检测色谱图；图4是本申请实验例3的检测色谱图图5是本申请实验例4的检测色谱图。具体实施方式为使本申请的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下参照附图并举实施例对本申请进一步详细说明。本申请提供一种齐多夫定的基因毒性杂质的高效液相检测方法，其中，齐多夫定合成过程中生成的杂质imp2/imp3/imp4均含有磺酸酯结构，属于基因毒性杂质。而杂质imp2/imp3/imp4是在制备中间体ZI04(具体结构详见表1)工序中未转化完全的起始原料β-胸苷与甲磺酰氯发生副反应而产生的。从反应机理来看，由于β-胸苷的残留可控(通常该原料的残留<3％)，因此甲磺酰氯的摩尔配比就非常的大(根据甲磺酰氯的使用配比，甲磺酰氯与残留的β-胸苷摩尔配比>50eq)，导致imp2/imp3继续反应全部转化成为imp4。因此对齐多夫定基因毒性杂质的控制，主要是控制imp4的量。由于基因毒性杂质限度极低，在检测时需要极大地进样浓度，而进样浓度变大时，样品分析溶液中的产品主峰不可避免地会因样品过载出现拖尾现象，而与产品极性相近的杂质imp4的定量不可避免地会受主峰拖尾的影响。本申请的专利技术人经研究发现imp4在ZI04工序之后的反应中，不会进一步生成和增大，为了能够精确的控制齐多夫定中的基因毒性杂质，本申请利用反相高效液相色谱(Reversed-phaseHighPerformanceLiquidChromatogra，RT-HPLC或RP-HPLC)法，在中间体环节进行基因毒性杂质imp4的控制。其中，齐多夫定的中间体ZI04、基因毒性杂质imp2、imp3、imp4的结构见表1。表1：中间体ZI04、基因毒性杂质imp2/imp3/imp4的名称及结构请参阅图1，图1是本申请齐多夫定的基因毒性杂质的高效液相检测方法第一实施方式的流程示意图。在该实施方式中，检测方法包括如下步骤：S101：提供样品分析溶液。其中，在制备样品分析溶液时，考虑到检测限问题，应控制样品分析溶液中杂质的含量在适当范围内，如杂质含量可以是10～100ng。S102：将样品分析溶液注入高效液相色谱仪进行色谱分析，并记录色谱图；其中色谱柱为反相色谱柱，流动相为酸铵盐溶液与有机相的混合液。其中，根据色谱仪的规格要求，先设定检测条件，待仪器运行稳定后，进样，利用流动相进行洗脱，并记录色谱图，对色谱图进行分析，得出杂质含量。在该实施方式中，通过利用反相色谱柱，并使用酸铵盐溶液和有机相的混合溶剂进行洗脱，能够提高基因毒性杂质的检测分离度和检测限度。其中，在一实施方式中，利用甲醇、乙腈单一溶剂，或甲醇-水的混合溶剂，或乙腈-水的混合溶剂作为溶剂溶解样品，进而制得样品分析溶液。具体地，由于杂质imp2/imp3会转化成为imp4，因此可以不单独控制杂质imp2/imp3的含量，而是控制反应的投料，将杂质imp2/imp3全部转化成为imp4，通过控制imp4的含量来控制杂质的含量。同时，由于imp4在ZI04工序之后的反应中，不会进一步生成和增大，因此，可以在制备中间体ZI04这一工序中对杂质imp4进行控制。其中，根据基因毒性杂质imp4和齐多夫定中间体ZI04在不同溶剂中的溶解性差异，本申请专利技术人通过对溶剂筛选，发现通过改变样品分析溶液的溶剂可以增大样品分析溶液中杂质的浓度，同时本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种齐多夫定的基因毒性杂质的高效液相检测方法，其特征在于，所述方法包括：提供样品分析溶液；将所述样品分析溶液注入高效液相色谱仪进行色谱分析，并记录色谱图；其中所用的色谱柱为反相色谱柱，所用的流动相为酸铵盐溶液与有机相的混合液。

【技术特征摘要】
1.一种齐多夫定的基因毒性杂质的高效液相检测方法，其特征在于，所述方法包括：提供样品分析溶液；将所述样品分析溶液注入高效液相色谱仪进行色谱分析，并记录色谱图；其中所用的色谱柱为反相色谱柱，所用的流动相为酸铵盐溶液与有机相的混合液。2.根据权利要求1所述的齐多夫定的基因毒性杂质的高效液相检测方法，其特征在于，所述提供样品分析溶液包括：利用甲醇、乙腈、甲醇-水混合液或乙腈-水混合液对样品进行溶解，制得所述样品分析溶液。3.根据权利要求2所述的齐多夫定的基因毒性杂质的高效液相检测方法，其特征在于，所述样品为齐多夫定原料药、齐多夫定中间体或齐多夫定制剂。4.根据权利要求1所述的齐多夫定的基因毒性杂质的高效液相检测方法，其特征在于，所述流动相中酸铵盐溶液与有机相的混合体积比为95:5～50:50，所述流动相的pH值为4.0～8.0。5.根据权利要求1所述的齐多夫定的基因毒性杂质的高效液相检测方法，其特征在于，采用梯度洗脱的方式进行洗脱，其中，梯度洗脱时，在运行时间的0～10分钟范围内，所述流动相中酸铵溶液的体积比为90～30％，在运行时间的10～20分钟范围内，所述流动相中酸铵溶液的体积比为35～5％，在运行时间的20～21分钟范围内，...

【专利技术属性】
技术研发人员：周洁，李春刚，丁屏，高衎，葛红娟，施健峰，
申请(专利权)人：上海现代制药海门有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32