基于电化学发光特性传感的转肽酶检测方法技术

本发明专利技术公开了一种基于电化学发光特性传感的转肽酶检测方法，具体包括以下步骤：水合铱配合物的制备、连接反应、信号探针标记以及电化学发光检测，利用金属环化铱配合物的电化学发光特性进行传感，通过电化学发光强度的变化判断转肽酶的浓度、活性变化；本发明专利技术能快速对转肽酶的浓度和活性进行检测，检测过程简单、易操作，并且检测所用试剂及设备价格低廉，检测过程环保无污染。

Detection of transpeptidase based on electrochemiluminescence sensing

The invention discloses a transpeptidase detection method based on electrochemiluminescence sensing, which includes the following steps: preparation of iridium hydrate complex, connection reaction, signal probe labeling and electrochemiluminescence detection, sensing by electrochemiluminescence characteristics of iridium metal cyclide complex, and judging the concentration and activity change of transpeptidase by electrochemiluminescence intensity change. The invention can quickly detect the concentration and activity of transpeptidase, the detection process is simple and easy to operate, and the reagents and equipment used for detection are cheap, and the detection process is environmentally friendly and pollution-free.

【技术实现步骤摘要】
基于电化学发光特性传感的转肽酶检测方法
本专利技术属于分析化学和生物传感
，特别是涉及一种基于电化学发光特性传感的转肽酶检测方法。
技术介绍
SortaseA是一组存在于革兰氏阳性细菌中，能够介导表面蛋白与细胞壁共价结合的一种转肽蛋白酶，主要负责对细胞表面蛋白的修饰以及细菌鞭毛的构建，目前一种来源于金黄色葡萄球菌的SortaseA由于能够催化C端含有LPxTG(x代表任一种氨基酸残基)序列的底物多肽，与N端含有寡聚甘氨酸序列的底物发生连接反应，得到广泛的研究；一方面，基于SortaseA作用的多肽间连接反应具有特异性高，便捷高效的特点，可以用于多肽与多肽、蛋白质、核酸类似物、多糖等活性物质的连接以及蛋白质的固定化，并显示出良好的应用前景；另一方面，SortaseA是细菌表面蛋白分泌定位到细胞壁的过程中起到关键作用的酶，与细菌的致病性密切相关，因此检测SortaseA对了解细菌染病机理和相关的连接作用有着重要意义。电化学发光检测法是一种利用电化学反应引起化学发光的现象检测目标化合物的方法，具有操作简便、背景信号低、易于控制、特异性高等特点；金属环化铱配合物具有良好的电化学发光和荧光性质，可以作为电化学发光示踪物，以三乙胺(TPA)为共反应剂，构建相关的电化学发光传感体系；组氨酸及含组氨酸残基的多肽可以通过咪唑基与水合铱配合物(Ir(OH2)2)配位结合，形成组氨酸-金属环化铱配合物，利用该配位性质，可以使用水合铱配合物实现对含组氨酸残基的多肽进行电化学探针标记，再结合金属环化铱配合物的电化学发光性质，可用于检测SortaseA。目前，转肽酶的定量检测主要采用免疫印迹法、放射性同位素标记法等，免疫印迹法需要昂贵的生物试剂、耗时长，且检测仪器要求比较高、价格昂贵，而放射性同位素标记法需要放射性同位素标记，试剂昂贵且存在放射性污染，因此，设计一种简单快速、成本低廉、环保无污染的转肽酶检测方法具有重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种基于电化学发光特性传感的转肽酶检测方法，以实现简单快速地对转肽酶进行检测，检测所用试剂、设备价格低廉，检测耗时短且环保无污染。本专利技术所采用的技术方案是，基于电化学发光特性传感的转肽酶检测方法，具体包括以下步骤：步骤1：水合铱配合物的制备a、取[Ir(bpy)2Cl]2溶于二氯甲烷中；b、取AgOTf溶于甲醇溶液中；c、将b制备的溶液缓慢滴加到搅拌中的a制备的溶液中；d、室温下反应1小时，减压过滤，用二氯甲烷洗涤；e、取滤液，减压蒸馏除去二氯甲烷和甲醇，得到黄色粉末即为反应产物Ir(OH2)2；步骤2：连接反应及信号探针标记a、多肽连接反应将反应底物P1、P2以及SortaseA加入到反应缓冲液中，混合均匀，多肽连接反应2h，生成P3；其中P1：Ac-GALPHTGAT-CH3，P2：GGGHGA-CH3，P3：Ac-GALPHTGGGHGA-CH3；b、向a的反应体系中加入500μM步骤1制备的Ir(OH2)2混合均匀，生成金属环化铱配合物，在37℃恒温培养箱中孵育30min，对金属环化铱配合物进行电化学探针标记；步骤3：电化学发光检测取5μL电化学探针标记后的金属环化铱配合物，注入到含有400μL发光检测液的ITO工作电极检测池中，以铂丝为对电极，Ag/AgCl电极为参比电极，在工作电极上施加0.2V～1.25V的电压，毛细管高压750V，放大级数3倍，检测工作电极上的电化学发光信号。进一步的，步骤1a制备的溶液中[Ir(bpy)2Cl]2的浓度为10.72mgmL-1。进一步的，步骤1b制备的溶液中AgOTf的浓度为5.24mgmL-1。进一步的，步骤2a中P1、P2、SortaseA和反应缓冲液的体积比为2:2:1:15，P1与P2的浓度比为1:4。进一步的，步骤2a中反应缓冲液由130mMNaCl，10mMCaCl2，pH＝7.5、50mM三羟甲基氨基甲烷溶液组成。进一步的，步骤2b中加入的Ir(OH2)2体积为步骤2a中反应体系体积的四分之一。进一步的，步骤3中的发光检测液由2μL、80mMTPA加入到398μL、0.2M、pH＝8.0PBS缓冲溶液配置成终浓度为400μMTPA的PBS缓冲溶液。本专利技术的有益效果是：利用SortaseA含有组氨酸残基，可以与水合铱配合进而构建电化学发光体系，再结合金属环化铱配合物的电化学发光性质进行电化学发光检测；本专利技术实验操作简单，检测过程易控制、耗时短、成本低、准确性高；能直接对转肽酶的作用效果进行检测分析，定量、定性地判断转肽酶的浓度和活性，并依此判断转肽酶影响因素的效果。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1(A)是金属铱配合物的循环伏安曲线；(B)是相应的电化学发光图；图2是有无SortaseA的电化学发光对比图；图3是不同多肽与水合铱配合物物(Ir(OH2)2)结合的实时荧光曲线；图4是ECL强度随SortaseA反应时间变化曲线；图5是底物多肽浓度比例与反应产物ECL强度关系图；图6(A)是不同SortaseA浓度下金属环化铱配合物的电化学发光强度曲线；(B)是相应信号处理后的线性拟合曲线；图7是盐酸小檗碱浓度与信背比的关系曲线；图8是不同浓度SortaseA在细胞裂解液中的ECL强度图。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。基于电化学发光特性传感的转肽酶检测方法，具体包括以下步骤：步骤1：水合铱配合物的制备a、取[Ir(bpy)2Cl]2溶于二氯甲烷中，制成[Ir(bpy)2Cl]2浓度为10.72mgmL-1的溶液；b、取AgOTf溶于甲醇溶液中，制成AgOTf浓度为5.24mgmL-1的溶液；c、将b制备的溶液缓慢滴加到搅拌中的a制备的溶液中；d、室温下反应1小时，减压过滤，用二氯甲烷洗涤；e、取滤液，减压蒸馏除去二氯甲烷和甲醇，得到黄色粉末即为反应产物Ir(OH2)2；步骤2：连接反应及信号探针标记a、多肽连接反应将反应底物2μL、10μMP1，2μL、40μMP2以及1μL、200nMSortaseA加入到15μL反应缓冲液中，形成共计20μL体系并混合均匀，多肽连接反应2h，生成P3；其中反应缓冲液由130mMNaCl，10mMCaCl2，pH＝7.5、50mM三羟甲基氨基甲烷溶液组成；其中P1：Ac-GALPHTGAT-CH3，P2：GGGHGA-CH3，P3：Ac-GALPHTGGGHGA-CH3；b、向a的反应体系中加入5μL、500μM步骤1制备的Ir(OH2)2混合均匀，生成金属环化铱配合物，在37℃恒温培养箱中孵育30min，对金属环化铱配合物进行电化学探针标记，其反应式如式(1)；步骤3：电化学发光检测取5μL电化学探本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.基于电化学发光特性传感的转肽酶检测方法，其特征在于，具体包括以下步骤：步骤1：水合铱配合物的制备a、取[Ir(bpy)2Cl]2溶于二氯甲烷中；b、取AgOTf溶于甲醇溶液中；c、将b制备的溶液缓慢滴加到搅拌中的a制备的溶液中；d、室温下反应1小时，减压过滤，用二氯甲烷洗涤；e、取滤液，减压蒸馏除去二氯甲烷和甲醇，得到黄色粉末即为反应产物Ir(OH2)2，步骤2：连接反应及信号探针标记a、多肽连接反应将反应底物P1、P2以及Sortase A加入到反应缓冲液中，混合均匀，多肽连接反应2h，生成P3；其中P1：Ac‑GALPHTGAT‑CH3，P2：GGGHGA‑CH3，P3：Ac‑GALPHTGGGHGA‑CH3；b、向a的反应体系中加入500μM步骤1制得的Ir(OH2)2混合均匀，生成金属环化铱配合物Ir‑P3，在37℃恒温培养箱中孵育30min，对金属环化铱配合物进行电化学探针标记；步骤3：电化学发光检测取5μL电化学探针标记后的金属环化铱配合物，注入到含有400μL发光检测液的ITO工作电极检测池中，以铂丝为对电极，Ag/AgCl电极为参比电极，在工作电极上施加0.2V～1.25V的电压，毛细管高压750V，放大级数3倍，检测工作电极上的电化学发光信号。...

【技术特征摘要】
1.基于电化学发光特性传感的转肽酶检测方法，其特征在于，具体包括以下步骤：步骤1：水合铱配合物的制备a、取[Ir(bpy)2Cl]2溶于二氯甲烷中；b、取AgOTf溶于甲醇溶液中；c、将b制备的溶液缓慢滴加到搅拌中的a制备的溶液中；d、室温下反应1小时，减压过滤，用二氯甲烷洗涤；e、取滤液，减压蒸馏除去二氯甲烷和甲醇，得到黄色粉末即为反应产物Ir(OH2)2，步骤2：连接反应及信号探针标记a、多肽连接反应将反应底物P1、P2以及SortaseA加入到反应缓冲液中，混合均匀，多肽连接反应2h，生成P3；其中P1：Ac-GALPHTGAT-CH3，P2：GGGHGA-CH3，P3：Ac-GALPHTGGGHGA-CH3；b、向a的反应体系中加入500μM步骤1制得的Ir(OH2)2混合均匀，生成金属环化铱配合物Ir-P3，在37℃恒温培养箱中孵育30min，对金属环化铱配合物进行电化学探针标记；步骤3：电化学发光检测取5μL电化学探针标记后的金属环化铱配合物，注入到含有400μL发光检测液的ITO工作电极检测池中，以铂丝为对电极，Ag/AgCl电极为参比电极，在工作电极上施加0.2V～1.25V的电压，毛细管高压750V，放大级数3倍，检测工作电极...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈红军，刘秀，
申请(专利权)人：湖南人文科技学院，
类型：发明
国别省市：湖南,43