基于金纳米团簇探针的人附睾蛋白4检测方法及其试剂盒技术

本发明专利技术公开一种基于金纳米团簇探针的人附睾蛋白4检测方法及其试剂盒。本发明专利技术以人附睾蛋白4为检测对象，将高量子产率金纳米团簇电致化学发光技术和免疫分析技术有机结合，采用还原法制备高量子产率金纳米团簇电致化学发光探针，以二氧化锰纳米材料作为电致化学发光猝灭剂，利用酶联免疫反应产生的抗坏血酸与二氧化锰的氧化还原反应恢复电致化学发光信号，为一种基于高量子产率金纳米团簇探针的高性能电致化学发光人附睾蛋白4检测方法。其对人附睾蛋白4检测线性范围为0.01 pmol/L~6 pmol/L，检测限为0.004 pmol/L。具有快速、准确、灵敏度高、选择性和稳定性好、样品用量少等特点，具有较好的临床应用前景。

Detection of human epididymal protein 4 based on gold nanocluster probe and its kit

The invention discloses a method for detecting human epididymal protein 4 based on gold nanocluster probe and a kit thereof. The invention takes human epididymal protein 4 as the detection object, organically combines high quantum yield gold nanoclusters electrochemiluminescence technology with immunoassay technology, uses reduction method to prepare high quantum yield gold nanoclusters electrochemiluminescence probes, uses manganese dioxide nanomaterials as electrochemiluminescence quenching agent, and uses ascorbic acid and manganese dioxide oxidation produced by enzyme-linked immunoreaction. Reduction reaction restores the electrochemiluminescence signal, which is a high performance Electrochemiluminescence Method for human epididymis protein 4 Detection Based on gold nanocluster probes with high quantum yield. The linear range of human epididymal protein 4 was 0.01 pmol/L~6 pmol/L, and the detection limit was 0.004 pmol/L. It has the characteristics of fast, accurate, high sensitivity, good selectivity and stability, and less sample dosage. It has good clinical application prospects.

【技术实现步骤摘要】
基于金纳米团簇探针的人附睾蛋白4检测方法及其试剂盒
本专利技术涉及一种基于高量子产率金纳米团簇探针的电致化学发光人附睾蛋白4检测方法及其检测试剂盒，属于分析化学及纳米

技术介绍
恶性肿瘤是影响人民生命健康的一类重要疾病，成为全球最大的公共卫生问题。在女性生殖系统中，卵巢癌在妇科恶性肿瘤中的发病率排名第三，死亡率排在第一位。近70％的卵巢癌患者被诊断为晚期，卵巢癌患者的5年生存率通过早期有效治疗上升至90％。因此，早期诊断对于改善卵巢癌的预后至关重要。目前，最常用于卵巢癌早期诊断的血清生物标志物是CA125。但对于盆腔炎患者，如子宫内膜异位症、结核性腹膜炎，血清中的CA125也可能升高。因此，CA125在卵巢癌诊断中的应用表现出较高的假阳性率，有时会导致不必要的手术。人附睾蛋白4（Humanepididymisprotein4，HE4）被认为是卵巢癌早期诊断的新生物标志物。据报道，HE4对早期卵巢癌高度敏感，可与CA125联合使用，为卵巢癌及其他盆腔肿块的鉴别诊断提供最佳方法。目前用于检测血清中人附睾蛋白4含量的免疫分析方法已发展出很多种，如酶联免疫分析法、化学发光免疫分析法、电致化学发光免疫分析和荧光免疫分析法等。酶联免疫分析法在过去三十年内一直被认为是最成熟的方法和黄金标准,但酶联免疫分析法仍然有一定的缺陷，如灵敏低，无法检测到血清中极微量的生物标志物。化学发光免疫分析法也有一些缺点,包括体型较大的分析仪器,高成本和特殊标记要求等。这些因素限制着这些技术的临床应用。电致化学发光免疫分析是近几年发展迅速的一种新型免疫检测方法，该技术具有多样化，更好的灵敏度和选择性，背景信号低，光学装置简单，时间/空间控制性好，线性范围宽等性能特点，己在临床分析及医药、免疫等领域广泛应用，如慢性阻塞性肺病和哮喘的诊断。寻找新型发光体，发展性能优良的电致化学发光体系是电致化学发光分析的重要研究方向。2002年首次报道了硅纳米粒子的ECL现象，随后涌现了大量纳米材料作为新的ECL发光体，尤其是量子点（CdS、ZnS、CdTe）已被广泛应用于ECL体系。金纳米团簇由几十到几百个金原子组成，具有的生物相容性好、量子尺寸效应、特殊光电性质等特性，在催化、传感和光电子学等领域被广泛应用。但是由于其电致化学发光强度小、量子产率低、发光机制不清楚等问题的限制，金纳米团簇在电致化学发光领域的研究还非常少。针对上述问题，本课题组通过控制金簇价态的方法制备得到了高量子产率的金纳米团簇探针，并将其应用于细胞释放多巴胺的检测及小分子生物硫醇等生物分子的高灵敏、快速检测。面对临床肿瘤诊疗的迫切需求，设计和开发了一种新型高量子产率金纳米团簇电致化学发光探针的免疫传感器并将其用于肿瘤标志物的检测具有较重要的学术创新性和临床应用价值。本专利技术提供了一种基于高量子产率金纳米团簇探针的电致化学发光人附睾蛋白4检测方法，及基于该方法制备的检测试剂盒。
技术实现思路
本专利技术的一个目的在于提供一种基于高量子产率金纳米团簇探针的电致化学发光人附睾蛋白4检测方法。本专利技术的另一个目的在于提供一种基于高量子产率金纳米团簇探针的电致化学发光人附睾蛋白4检测试剂盒。为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：一种基于高量子产率金纳米团簇探针的电致化学发光人附睾蛋白4检测方法，其特征在于：首先在电极表面修饰金纳米团簇，通过还原法制备高量子产率金纳米团簇电致化学发光探针，并进一步在电极表面修饰二氧化锰纳米材料，将其作为电致化学发光信号猝灭剂；在空白酶标板固定人附睾蛋白4抗体，加入人附睾蛋白4，再加入生物素标记的人附睾蛋白4抗体，形成夹心免疫复合物；加入链霉亲和素-碱性磷酸酶，再加入2-磷酸-L-抗坏血酸三钠盐，通过碱性磷酸酶选择性水解2-磷酸-L-抗坏血酸三钠盐产生抗坏血酸；取出反应液，将电极浸入反应液中，电极表面的二氧化锰与反应液中的抗坏血酸发生氧化还原反应；采集修饰电极的电致化学发光信号，根据电致化学发光信号的改变实现人附睾蛋白4的检测。所述还原法制备高量子产率金纳米团簇电致化学发光探针采用下述的电化学还原法或化学还原法制备：（1）电化学还原法：采用三电极体系进行还原，以金纳米团簇修饰玻碳电极为工作电极，铂丝电极为对电极，Ag/AgCl为参比电极，将上述电极插入0.1mol/L、pH7.4磷酸盐缓冲溶液中，施加-1.4V~-2V范围内负电位电压，进行恒电位还原处理5min~1h，得到电化学发光金纳米团簇探针；（2）化学还原法：将金纳米团簇修饰玻碳电极浸泡在0.1~1mol/L硼氢化钠溶液反应5min~30min，得到化学还原法制备的金纳米团簇探针修饰电极。所述电极表面修饰二氧化锰纳米材料采用下述的电化学沉积法或滴涂法制备：（1）电化学沉积法：采用三电极体系，以还原法处理金纳米团簇修饰电极为工作电极，铂丝电极为对电极，Ag/AgCl为参比电极，采用I-t法，在1:1V/V的KMnO4-H2SO4溶液中，电沉积二氧化锰，沉积电位为-0.1V~-0.5V，沉积时间为100s~600s，清洗，氮气吹干；（2）滴涂法：首先制备二氧化锰纳米片，取500μL、10mmol/L的KMnO4溶液加入到1.25mL、0.1mol/L、pH6.0的缓冲溶液中，加入去离子水使溶液最后的体积成5mL后超声30min，结束后12000r.p.m离心10min，用水洗3次，重新分散于2.5mL去离子水中，得到二氧化锰纳米片溶液；取5μL滴涂于金纳米团簇修饰电极表面，自然晾干。所述在空白酶标板固定人附睾蛋白4抗体的方法为自组装法：取空白酶标板，在空白酶标板样品孔中加入1~5mg/mLpH8.5的多巴胺溶液50~100μL，于4℃反应1~5h，反应结束后用水轻轻漂洗，拍干；再滴加0.1~0.5mg/mL人附睾蛋白4抗体溶液，4℃孵育8~12h，漂洗；加入50~100μL1wt%~5wt%的牛血清白蛋白溶液，于4℃反应0.5~2h，洗涤，拍干。所述加入人附睾蛋白4，再加入生物素标记的人附睾蛋白4抗体，形成夹心免疫复合物的方法为：在固定有人附睾蛋白4抗体酶标板的样品反应孔中加入人附睾蛋白4样本，盖上封板膜，轻轻振荡混匀，37℃温育30min~60min，洗涤，拍干；加入0.1~10μg/mL生物素标记的人附睾蛋白4抗体50μL，37℃温育30min~60min，洗涤，拍干。所述加入链霉亲和素-碱性磷酸酶，再加入2-磷酸-L-抗坏血酸三钠盐的方法为：在形成夹心免疫复合物的酶标板孔中每孔分别加入50μL的0.1~1U/mL链霉亲和素-碱性磷酸酶和5~10mmol/L2-磷酸-L-抗坏血酸三钠盐溶液，轻轻振荡混匀，避光反应，37℃温育30min~60min。所述采集修饰电极的电致化学发光信号方法如下：采用三电极体系进行测试，以修饰电极为工作电极，铂丝电极为对电极，Ag/AgCl为参比电极，缓冲溶液为磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲溶液，所用电解质为KCl或KNO3；将上述电极插入含有过硫酸根离子共反应剂的缓冲溶液中，施加一定的扫描电压，工作电极表面产生电致化学发光辐射，光电倍增管高压设置为600~800V，检测电致化学发光辐射信号。所述根据电致化学发光信号的改变实现人附睾蛋白4的检测为：电极表面所采集的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于高量子产率金纳米团簇探针的电致化学发光人附睾蛋白4检测方法，其特征在于：首先在电极表面修饰金纳米团簇，通过还原法制备高量子产率金纳米团簇电致化学发光探针，并进一步在电极表面修饰二氧化锰纳米材料，将其作为电致化学发光信号猝灭剂；在空白酶标板固定人附睾蛋白4抗体，加入人附睾蛋白4，再加入生物素标记的人附睾蛋白4抗体，形成夹心免疫复合物；加入链霉亲和素‑碱性磷酸酶，再加入2‑磷酸‑L‑抗坏血酸三钠盐，通过碱性磷酸酶选择性水解2‑磷酸‑L‑抗坏血酸三钠盐产生抗坏血酸；取出反应液，将电极浸入反应液中，电极表面的二氧化锰与反应液中的抗坏血酸发生氧化还原反应；采集修饰电极的电致化学发光信号，根据电致化学发光信号的改变实现人附睾蛋白4的检测。

【技术特征摘要】
1.一种基于高量子产率金纳米团簇探针的电致化学发光人附睾蛋白4检测方法，其特征在于：首先在电极表面修饰金纳米团簇，通过还原法制备高量子产率金纳米团簇电致化学发光探针，并进一步在电极表面修饰二氧化锰纳米材料，将其作为电致化学发光信号猝灭剂；在空白酶标板固定人附睾蛋白4抗体，加入人附睾蛋白4，再加入生物素标记的人附睾蛋白4抗体，形成夹心免疫复合物；加入链霉亲和素-碱性磷酸酶，再加入2-磷酸-L-抗坏血酸三钠盐，通过碱性磷酸酶选择性水解2-磷酸-L-抗坏血酸三钠盐产生抗坏血酸；取出反应液，将电极浸入反应液中，电极表面的二氧化锰与反应液中的抗坏血酸发生氧化还原反应；采集修饰电极的电致化学发光信号，根据电致化学发光信号的改变实现人附睾蛋白4的检测。2.根据权利要求1所述的一种基于高量子产率金纳米团簇探针的电致化学发光人附睾蛋白4检测方法，其特征是所述还原法制备高量子产率金纳米团簇电致化学发光探针采用下述的电化学还原法或化学还原法制备：（1）电化学还原法：采用三电极体系进行还原，以金纳米团簇修饰玻碳电极为工作电极，铂丝电极为对电极，Ag/AgCl为参比电极，将上述电极插入0.1mol/L、pH7.4磷酸盐缓冲溶液中，施加-1.4V~-2V范围内负电位电压，进行恒电位还原处理5min~1h，得到电化学发光金纳米团簇探针；（2）化学还原法：将金纳米团簇修饰玻碳电极浸泡在0.1~1mol/L硼氢化钠溶液反应5min~30min，得到化学还原法制备的金纳米团簇探针修饰电极。3.根据权利要求1所述的一种基于高量子产率金纳米团簇探针的电致化学发光人附睾蛋白4检测方法，其特征是所述电极表面修饰二氧化锰纳米材料采用下述的电化学沉积法或滴涂法制备：（1）电化学沉积法：采用三电极体系，以还原法处理金纳米团簇修饰电极为工作电极，铂丝电极为对电极，Ag/AgCl为参比电极，采用I-t法，在1:1V/V的KMnO4-H2SO4溶液中，电沉积二氧化锰，沉积电位为-0.1V~-0.5V，沉积时间为100s~600s，清洗，氮气吹干；（2）滴涂法：首先制备二氧化锰纳米片，取500μL、10mmol/L的KMnO4溶液加入到1.25mL、0.1mol/L、pH6.0的缓冲溶液中，加入去离子水使溶液最后的体积成5mL后超声30min，结束后12000r.p.m离心10min，用水洗3次，重新分散于2.5mL去离子水中，得到二氧化锰纳米片溶液；取5μL滴涂于金纳米团簇修饰电极表面，自然晾干。4.根据权利要求1所述的一种基于高量子产率金纳米团簇探针的电致化学发光人附睾蛋白4检测方法，其特征是所述在空白酶标板固定人附睾蛋白4抗体的方法为自组装法：取空白酶标板，在空白酶标板样品孔中加入1~5mg/mLpH8.5的多巴胺溶液50~100μL，于4℃反应1~5h，反应结束后用水轻轻漂洗，拍干；再滴加0.1~0.5mg/mL人附睾蛋白4抗体溶液，4℃孵育8~12h，漂洗；加入50~100μL1wt%~5wt%的牛血清白蛋白溶液，于4℃反应0.5~2h，洗涤...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈伟，彭花萍，黄种南，何少斌，黄开源，
申请(专利权)人：福建医科大学，
类型：发明
国别省市：福建,35