一种快速检测遗传性皮肤敏感基因的方法技术

本发明专利技术为一种快速检测遗传性皮肤敏感基因的方法，涉及分子生物学领域。本发明专利技术涉及检测三个基因、四个SNP位点，提供四个待检测位点的检测用特异性引物(详见表1)。本发明专利技术采用高分辨率熔解曲线分析技术(High Resolution Melting，HRM)以分析待检测样本的各SNP位点基因型。为辅助分析待检测样品的基因型，本发明专利技术还将提供各SNP位点对应标准基因型模板(含野生型、突变杂合型及突变型)。

【技术实现步骤摘要】
一种快速检测遗传性皮肤敏感基因的方法
本专利技术为一种快速检测遗传性皮肤敏感基因的方法，涉及分子生物学领域，尤其针对美肤行业肤质评测。
技术介绍
目前，常用的基因检测方法为测序法、基因芯片法、飞行质谱法，这些方法都需要在完成PCR扩增后进行后续实验分析，实验周期相对较长，适用于中、高通量的SNP检测。使用支持高分辨率熔解曲线分析技术(HighResolutionMelting，HRM)的仪器仅需要一次PCR扩增后即可根据扩增产物直接进行分析报告得出样品的基因型，极大的缩短了实验时长。HRM是一种基于单核苷酸熔解温度不同而形成不同形态熔解曲线的基因分析新技术，具有极高的敏感性，可以检测出单个碱基的差异，并且成本低、通量高、速度快、结果准确、不受检测位点的局限，实现了真正的闭管操作。HRM无需使用序列特异性探针，而是利用一种饱和染料对PCR反应产物进行分析。基本原理：双链核苷酸(doublestrandDNA，dsDNA)的热稳定性受具长度和碱基组成的影响，序列变化会导致升温过程中dsDNA解链行为的改变。因为所用的荧光染料只能嵌入并结合到dsDNA上，因此利用实时PCR技术，通过实时检测dsDNA熔解过程中荧光信号值的变化，就能以生成不同形状熔解曲线的方式将PCR产物中存在的差异直观地展示出来。同时，借助于专业性的分析软件就可以对测试群体实现基于不同形状熔解曲线的基因分型或归类。皮肤敏感性主要由皮肤物理屏障作用能力决定的，同时受皮肤免疫屏障作用能力、身体解毒能力影响。皮肤物理屏障作用能力通常由皮脂膜、角质层角蛋白、脂质、砖墙结构、真皮粘多糖类、粘多糖类等共同构成，抵御外界有害、刺激物、日光进入，同时具有保湿及调节抗炎作用；皮肤免疫屏障作用能力则由相关酶调节控制免疫细胞，达到抗炎症效果；身体解毒能力是相关水解酶参与转化有害物质的过程，身体必须及时处理进入皮肤的有害物质，防止皮肤过敏反应。丝氨酸蛋白酶抑制因子5基因(erinepeptidaseinhibitor，Kazaltype5，SPINK5)该基因编码多结构域丝氨酸蛋白酶抑制剂，其含有15个潜在的抑制结构域，对编码的前体蛋白进行蛋白水解加工以产生多种蛋白质产物。这些蛋白质多存在皮肤、毛发以及粘液中保护作用，主要作用为上皮细胞的抗炎和抗微生物。该基因的突变可能导致Netherton综合征，这是一种以鱼鳞病、有缺陷的角质化和特应性为特征的疾病。中间丝相关蛋白(filaggrin，FLG)基因编码中间丝相关蛋白，主要的蛋白成分为角蛋白和中间丝相关蛋白，大约占到80％-90％。中间丝相关蛋白在皮肤屏障功能中起重要作用，它将最外层皮肤细胞中的结构蛋白结合在一起，形成紧密的束状物，使细胞平坦化和强化，形成强大的屏障，在维持表皮屏障的通透性，调节皮肤正常pH值，防御微生物对皮肤的侵犯等都起重要作用。微粒体环氧化物水解酶(epoxidehydrolase1，EPHX1)基因编码合成环氧化水解酶，环氧化物水解酶是一种关键的生物转化酶，可将环氧化物(环氧化物是高活性的亲电子化合物，与DNA和蛋白质形成加合物，并且还会导致DHA中的链断裂；因此，环氧化物可导致基因突变，癌症和关键蛋白的失活)从芳香族化合物的降解转化为反式二氢二醇(通常没有毒性或毒性远低于它们的环氧化物前体)，反式二氢二醇可从体内结合并排出体外。环氧化物水解酶在环氧化物的活化和解毒中起作用。
技术实现思路
为了加快检测速度、简化检测过程，本专利技术选用了HRM技术对与皮肤抗氧化能力相关的基因突变位点进行基因型分析。为实现这一检测我们提供了一组用于HRM试验的特异性扩增引物及对应的标准对照品。本专利技术涉及检测三个基因的四个SNP位点，提供四个待检测位点的检测用特异性引物及其使用LightCycler480HighResolutionMeltingMaster试剂盒特异性扩增DNA片段的反应体系和条件(详见表1)。本专利技术采用高分辨率熔解曲线分析技术(HighResolutionMelting，HRM)以分析待检测样本的各SNP位点基因型。为辅助分析待检测样品的基因型，本专利技术还提供各SNP位点对应标准基因型模板(含野生型、突变杂合型及突变型)。表1.检测用引物及其条件本专利技术通过以下技术方案实现(以其中某一特定位点：rs2303067为例)：1)设计扩增含rs2303067在内的过氧化氢酶特定基因片段的1组引物；2)将样品总DNA的浓度调至20ng/uL、制备一组含三种不同基因型的标准品；3)使用1)的引物和2)的模板及标准品，使用HRM试剂盒并根据试剂盒说明对过氧化氢酶基因片段的扩增；4)使用LightCycler480software软件对试验数据进行基因分型分析，确定样品的基因型。所述标准品的制备：a.通过PCR扩增筛选得到野生型及突变型基因(若突变型基因不易筛选可进行化学合成法)；b.将筛选所得的基因(野生型及突变型)连接到克隆常用质粒中，将连接后质粒进行转化扩增，最后回收连接成功的质粒(并将相应菌落进行菌种保存)c.将连接有两种基因型的质粒进行定量稀释处理，同时取两种不同质粒1：1混合即可得到突变杂合型模板。将这三种质粒进行定量处理，并取其中一部分稀释为工作浓度在后续实验中作为标准品DNA使用。所述试剂盒的反应体系及其反应条件：表2.PCR扩增反应体系序号试剂体积(μl)1①2×MasterMix102②MgCl2(25mM)2.43Primer16F0.44Primer16R0.45③H2O4.8表3.PCR扩增反应条件所述检测结果解读：判断样品的基因型，其特质在于不同基因型的dsDNA在解链时的温度有细微的差别，从而导致其溶解曲线在突变点位有不同的曲线形状。以添加的三种不同基因型标准品为参照即可得出样品的基因型。附图说明图1、2为三种不同基因型的标准品在突变位点的溶解曲线线型(被检测样品线型与其中某一条重合)图3为实例中的检测结果具体实施方式现结合实施例，进一步说明使用本专利技术的引物、标准品结合HRM试剂盒检测样品基因型的良好效果。本专利技术使用LightCycler480HighResolutionMeltingMaster试剂盒及LightCycler480仪器进行试验，但并不限制使用其他公司的仪器及试剂盒。以下操作均已rs20303067位点的检测过程为例。某位客户在刮取口腔上皮细胞之后，实验员进行核酸提取，将提取出的基因组DNA进行质量评估(检测其浓度及纯度)。根据所测得的浓度结果对样本进行稀释(稀释至工作浓度20ng/μL)。标准模板的制备：1)将筛选所得的基因(野生型及突变型)连接到克隆常用质粒中，将连接后质粒进行转化扩增，最后回收连接成功的质粒(并将相应菌落进行菌种保存)；2)将连接有两种基因型的质粒进行定量稀释处理，同时取两种不同质粒1∶1混合即可得到突变杂合型模板。将这三种质粒进行定量处理，并取其中一部分稀释为工作浓度在后续实验中作为标准品DNA使用。1.反应溶液配制1)根据表2中提供的反应体系避光配制除模板DNA外的公共体系(反应数量为样本数X+标准品数量3)，为避免多次移液操作造成损耗，应多配0.5个或数个反应的量；2)将公共体系按照每孔18μl分装置各孔；3)分装完毕，将板离心数秒钟本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种快速检测遗传性皮肤抗氧化基因的方法，其特征在于包括以下步骤：1)设计4对特异性引物，并确定各引物对的扩增条件；2)制备4组含三种不同基因型的标准品；3)将待检测样品总DNA的浓度稀释至20ng/μL作为模板；4)使用上述步骤中的引物及模板，借助HRM技术对各基因片段进行特异性扩增并测定其溶解曲线；5)根据4)中的实验结果，依据与标准品的线型关系判断样品的基因型。

【技术特征摘要】
1.一种快速检测遗传性皮肤抗氧化基因的方法，其特征在于包括以下步骤：1)设计4对特异性引物，并确定各引物对的扩增条件；2)制备4组含三种不同基因型的标准品；3)将待检测样品总DNA的浓度稀释至20ng/μL作为模板；4)使用上述步骤中的引物及模板，借助HRM技术对各基因片段进行特异性扩增并测定其溶解曲线；5)根据4)中的实验结果，依据与标准品的线型关系判断样品的基因型。2.如专利要求1所述的4对引物，其特征为下表所示：3.如权利要求1所述的5组标准品制备，其特征在于：1)通过PCR扩增筛选得到野生型及突变型基因(若突变型基因不易筛选可进行化学合成法)；2)将筛选所得的基因(野生型及突变型)连接到克隆常用质粒中，将连接后质粒进行转化扩增，最后回收连接成功的质粒(并将相应菌落进...

【专利技术属性】
技术研发人员：王亮，赵绍军，蒋桂瑾，
申请(专利权)人：广州益养生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44