转座酶随机引发性DNA样品制备制造技术

本申请提供，除其他事项之外，多种通过转座酶‑5介导的对短DNA片段(例如，长度在约150bp和1.5Kb之间)加标签和扩增的方法。在一些方面，所述方法包括，例如，使用随机或基因特异性引物，使用条形码化的转座酶用第一引物序列将DNA片段加标签，然后进行引物延伸反应以引入第二引物序列。还提供了用于进行所述方法的试剂盒。

Preparation of Random Initiative DNA Samples for Transposase

This application provides, among other things, a variety of methods for labeling and amplification of short DNA fragments (e.g., between 150 BP and 1.5 Kb) mediated by transposase 5. In some aspects, the methods described include, for example, using random or gene-specific primers, using barcoded transposases to tag DNA fragments with the first primer sequence, and then conducting primer extension reactions to introduce a second primer sequence. A kit for carrying out the method is also provided.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】转座酶随机引发性DNA样品制备背景下一代测序(NGS)技术已经使得全基因组测序(WGS)成为常规操作，多种多样的靶富集方法已使研究人员能够将测序力量集中在最重要的感兴趣区域。然而，对于将NGS应用于难以处理的靶DNA，如福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的实体肿瘤样品、无细胞或循环肿瘤DNA(cfDNA/ctDNA)或受损的DNA样品，仍然需要更好的方法。与此类靶标的测序相关的问题有：DNA的量可能非常小，DNA可能非常短(例如，片段化的DNA)或被化学修饰，等位基因频率可能非常低，等等。由于这些问题的存在，需要捕获许多DNA模板。具体而言，使用基于转座酶的标签化方法对较小的基因组DNA片段进行测序是具有挑战性的，因为许多这些方法需要插入相邻的两个转座酶以产生在每一末端上具有适当的测序引物结合位点的片段，并且这样的小片段通常长度不足以容纳相邻的转座酶。本公开特别提供了改进对这样的DNA样品加标签和进行扩增的组合物和方法，所述DNA样品用于下游分析，例如下一代测序。概述本公开的多个方面包括用于对样品中的DNA片段加标签/标签化的方法，其包括：(a)使包含双链DNA片段的样品与多个各自负载有本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种方法，所述方法包括：(a)使包含平均长度为150bp至1.5Kb的双链DNA片段的样品与多个各自负载有衔接子的转座酶双链体接触以产生带有衔接子标签的片段，其中所述衔接子包含双链体区和5'突出端区，所述双链体区包含转座酶识别序列，所述5'突出端区包含第一引物序列；(b)使用随机引物对带有衔接子标签的片段进行引物延伸反应以产生随机引物延伸产物，其中所述随机引物包含随机的3'序列和包含第二引物序列的5'序列；(c)使用在其3'端包含所述第一引物序列的正向引物与在其3'端包含所述第二引物序列的反向引物，通过聚合酶链反应(PCR)扩增(b)的随机引物延伸产物以产生PCR扩增产物。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.05.27 US 15/167,8231.一种方法，所述方法包括：(a)使包含平均长度为150bp至1.5Kb的双链DNA片段的样品与多个各自负载有衔接子的转座酶双链体接触以产生带有衔接子标签的片段，其中所述衔接子包含双链体区和5'突出端区，所述双链体区包含转座酶识别序列，所述5'突出端区包含第一引物序列；(b)使用随机引物对带有衔接子标签的片段进行引物延伸反应以产生随机引物延伸产物，其中所述随机引物包含随机的3'序列和包含第二引物序列的5'序列；(c)使用在其3'端包含所述第一引物序列的正向引物与在其3'端包含所述第二引物序列的反向引物，通过聚合酶链反应(PCR)扩增(b)的随机引物延伸产物以产生PCR扩增产物。2.权利要求1所述的方法，其中所述方法在步骤(b)之前进一步包括：(i)对带有衔接子标签的片段进行延伸或延伸/连接反应，以填充所述5'突出端区并填充带有衔接子标签的片段的空位；和(ii)用在其3'端包含所述第一引物序列的线性扩增引物进行至少一次线性扩增反应。3.权利要求2所述的方法，其中步骤(ii)包括进行2至30次线性扩增反应。4.任一前述权利要求所述的方法，其中：所述第一引物序列是第一测序引物序列，所述正向引物包含含有第一测序引物序列的5'尾，或所述衔接子进一步包含位于所述第一引物序列下游的第一测序引物序列；并且所述第二引物序列是第二测序引物序列，所述反向引物包含含有第二测序引物序列的5'尾，或所述随机引物进一步包含位于所述第二引物序列下游的第二测序引物序列。5.权利要求4所述的方法，其中所述第一和第二测序引物序列用于下一代测序应用。6.权利要求4所述的方法，其中：所述衔接子进一步包含位于所述第一测序引物序列下游的条形码；和/或所述随机引物进一步包含位于所述第二测序引物序列下游的条形码。7.权利要求6所述的方法，其中所述衔接子和/或随机引物中的条形码是样品特异性条形码。8.权利要求6所述的方法，其中所述衔接子和/或随机引物中的条形码包含简并碱基区(DBR)。9.权利要求4-8中任一项所述的方法，进一步包括将PC...

【专利技术属性】
技术研发人员：B·阿雷齐，M·博恩斯，H·霍格里夫，C·汉森，
申请(专利权)人：安捷伦科技有限公司，
类型：发明
国别省市：美国,US