环状RNA和microRNA在结直肠癌筛查诊断的应用制造技术

本发明专利技术提供对生物样品中的直肠结肠癌细胞进行筛查诊断的检测方法，所述的方法包括检测肿瘤组织或粪便样品中RNA序列的检验步骤，所述RNA包括环状RNA(hsa_circ_0006859、hsa_circ_0051240a、hsa_circ_0000722、hsa_circ_0000267和hsa_circ_0001190)和microRNA(miR‑21和miR‑135b)。circRNA和microRNA结构稳定且能反映细胞基因表达信息，为结直肠癌筛查诊断以及预后监测提供方便、快捷、准确的检测手段。

Application of Ring RNA and MicroRNA in Screening and Diagnosis of Colorectal Cancer

The present invention provides a detection method for screening and diagnosing rectal and colon cancer cells in biological samples. The method includes a detection step for RNA sequences in tumor tissues or fecal samples. The RNA includes cyclic RNA (hsa_circ_0006859, hsa_circ_0051240a, hsa_circ_0000722, hsa_circ_0000267 and hsa_circ_0001190) and microRNA (microRNAs 21 and microRNAs_135;b). The structure of circRNA and microRNA is stable and can reflect the gene expression information of cells. It provides a convenient, fast and accurate detection method for screening, diagnosis and prognosis monitoring of colorectal cancer.

【技术实现步骤摘要】
环状RNA和microRNA在结直肠癌筛查诊断的应用
本专利技术属于细胞核糖核酸(RNA)的应用，具体涉及多种环状RNA(circRNA)和microRNA，及其相关的基因表达检测方法和试剂盒，用于对结直肠组织以及肠道排泄物进行分析，以作为结直肠癌筛查诊断的特异生物学标志分子。
技术介绍
结直肠癌(Colorectalcancer，CRC，也称为结肠直肠癌或大肠癌)是癌症相关死亡的主要原因之一。CRC患者如果能够在疾病发生早期得到及时诊断和治疗，将会显著改善CRC生存率。由于大部分CRC患者早期阶段无症状表现，因而开发一种能够及早对CRC进行检测诊断的肿瘤筛查方法对于降低CRC发病率和死亡率至关重要(ForceUSPST等JAMA.2016；315：2564-2575)。虽然目前推荐结肠镜检查作为CRC的筛查方法，但由于其应用不便，尚未被人们广泛接受。另外，粪便潜血试验(FOBT)的灵敏度较低，需要细致的饮食限制。因此，从患者样品中检测CRC相关的生物标志物(Biomarker)是一种方便有效的肿瘤筛查和诊断方法。然而，缺乏稳定的生物标志物是目前癌症早期筛查的主要挑战之一，理想的CRC筛查和诊断的生物标志物尚未完全确定。因此，面对CRC早期检测灵敏度严重不足、CRC相关生物标志物缺乏稳定性的现状，急需开发出一种能够用于CRC早期检测的、具有高度灵敏度的、并且能够被稳定检测的理想生物标志物，从而为及早对CRC进行检测诊断提供手段。目前研究发现CRC的病因较为复杂，除了遗传因素，还涉及年龄、环境和饮食等。多种基因或表观遗传改变引起致癌基因激活和肿瘤抑制基因失活，导致结肠上皮细胞周期异常，出现无限增生。这些细胞遗传学改变反映了肿瘤发展的生物学过程，被认为是潜在的肿瘤细胞分子标记，能为临床医师提供诊断、预后和预测治疗反应信息。按照分子生物学中心法则，大量研究工作针对肿瘤细胞来源的DNA、RNA或蛋白质信息进行开发，以期获得新颖的生物标志物检测方法。与传统检测方法相比，分子生物学检测技术是一种灵敏度、准确度、特异性极高的检测方式。基因转录产生的RNA携带了细胞遗传信息，除了进一步编码成蛋白质，还能够直接与某些分子相互作用，已证明其参与了与肿瘤细胞增殖、凋亡和迁移相关的关键信号传导途径。在人转录组中，能翻译成蛋白质的mRNA比例很小，大部分为非编码RNA，例如长非编码RNA、核糖体RNA和microRNA等等。非编码RNA的检测可发展作为CRC发病机制相关的表观遗传标记，它们的表达模式揭示细胞行为和状态，是肿瘤细胞生物学研究的重要信息。随着RNA测序技术和生物信息学的发展，一种非编码RNA——环状RNA(circRNA)的发现已成为一个新研究热点。circRNA的生物学特性使其成为一类重要的临床诊断指标(BarrettSP等，Development.2016；143：1838-1847)。circRNA是一种非线型的环状核糖核酸。多种肿瘤组织表达不同丰度的circRNA。circRNA同时具有细胞类型特异性和生物学保守性。区别于其他RNA分子，circRNA的5’和3’首末端形成共价连接，并不被普通RNA酶降解，因此具有非常稳定的半衰期(＞48小时)。本研究通过对CRC标本进行高通量RNA测序分析，新发现数个与CRC相关的circRNA(SEQ-ID.1至5)。肿瘤相关基因转录环化拼接(Backsplicing)产生的circRNA可作为CRC的发生和发展的标志物。我们首次发现这些circRNA在CRC组织表达升高，然而circRNA的产生机制与肿瘤细胞的基因突变的联系需进一步研究。circRNA与其宿主基因表达水平不一定成正相关，但其联合检测可以为肿瘤细胞的发现提供更多实验证据。同时，大量研究发现其他非编码RNA例如microRNA也是一种重要的肿瘤细胞标志物。microRNA(miRNA)是长度为18至25个核苷酸的内源性小型非编码RNA，可调节特定蛋白质编码基因的翻译，参与了肿瘤的发生和发展(HollisM等，Worldiournalofgastroenterology.2015；21：8284-8292)。其中，miR-21和miR-135b在CRC患者及其粪便样品中的表达水平显著增加(WuCW等，ClinCancerRes.2014；20：2994-3002；WuCW等，Gut.2012；61：739-745)。MiR-21的高表达能提高多种肿瘤细胞的增殖、迁移、侵入能力，并提示疾病预后不良(LuZ等，Oncogene.2008；27：4373-4379；XiaX等，PLoSOne.2013；8：e80426)。研究表明，miR-135b高表达可以调节多种信号通路从而促进肿瘤细胞的恶化和发展，是肿瘤发生的重要机制(ValeriN等，CancerCell.2014；25：469-483)。鉴于CRC癌细胞转化机制的复杂性，本专利技术联合检测miR-21和miR-135b在活检组织和粪便样品中的表达水平，以增加CRC筛查诊断的准确性。另外，CRC样品的选择也是筛查试验的一个关键步骤。如上所述，结肠镜活检是CRC诊断的重要标准，但由于其侵入性而难以成为理想的常规筛查方法。人结直肠上皮细胞约以每小时1％的速度更新，细胞脱落至肠腔中并随粪便排出体外，而恶性上皮细胞更新和脱落的速度更快。因此，粪便样品中含有的上皮细胞的分泌因子和核酸为在体外条件下检测肿瘤细胞提供了可定量的方法。粪便样品的获取简便，检测成本较低，提高了患者肿瘤筛查依从性。美国预防医学工作组(USPSTF)向50至75岁人群推荐多种基于粪便样品的免疫组化和DNA检测试剂盒，并建议每年至少进行一次CRC筛查(ForceUSPST等，JAMA.2016；315：2564-2575)。多种RNA检测试剂盒尚处于开发和验证阶段，有望向受试人群提供更高准确度和灵敏度的CRC筛查方法。本专利技术旨在为CRC筛查诊断提供新的标志分子circRNA，其生物学结构特性可使其在肿瘤组织、粪便等生物样品中稳定保存，其检测结果为肿瘤细胞的发现提供更多更准确的实验证据。本专利技术用于CRC检测的circRNA和microRNA组合应用未见国内外有文献报道和相关的专利申请。
技术实现思路
本专利技术旨在建立用于结直肠癌筛查诊断的高灵敏度、高稳定性的方法，所述方法包括检测人体生物样品的hsa_circ_0006859、hsa_circ_0051240a、hsa_circ_0000722、hsa_circ_0000267和hsa_circ_0001190及其相应的宿主基因，同时检测miR-21和miR-135b的表达水平。其中，SEQ-ID.1对应于hsa_circ_0006859序列，SEQ-ID.2对应于hsa_circ_0051240a序列，SEQ-ID.3对应于hsa_circ_0000722序列，SEQ-ID.4对应于hsa_circ_0000267序列，SEQ-ID.5对应于hsa_circ_0001190序列，SEQ-ID.6对应于miR-21，SEQ-ID.7对应于miR-135b。在一些实施方案中，本专利技术涉及circRNA检测剂在制备用于结直肠癌筛查诊断的试剂中的用途，所述c本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.circRNA检测剂在制备用于结直肠癌筛查诊断的试剂中的用途，所述circRNA检测剂包含用于检测人体生物样品中的一种或更多种circRNA的一种或更多种检测剂，其中所述一种或更多种circRNA分别包含与SEQ‑ID.1至5之一的序列具有至少95％同一性的序列，并且所述一种或更多种cirRNA的存在提示所述样品中存在癌细胞。

【技术特征摘要】
1.circRNA检测剂在制备用于结直肠癌筛查诊断的试剂中的用途，所述circRNA检测剂包含用于检测人体生物样品中的一种或更多种circRNA的一种或更多种检测剂，其中所述一种或更多种circRNA分别包含与SEQ-ID.1至5之一的序列具有至少95％同一性的序列，并且所述一种或更多种cirRNA的存在提示所述样品中存在癌细胞。2.权利要求1所述的用途，其中所述circRNA检测剂包含用于检测1、2、3、4或5种所述circRNA之序列的一种或更多种检测剂。3.权利要求2所述的用途，其中所述circRNA检测剂包含用于对2、3、4或5种所述circRNA或其任意组合进行联合检测的一种或更多种检测剂。4.权利要求3所述的用途，其中所述circRNA检测剂包含用于检测人体生物样品中的2种circRNA的一种或更多种检测剂，其中所述2种circRNA分别包含与SEQ-ID.1至2之一的序列具有至少95％同一性的序列。5.权利要求3所述的用途，其中所述circRNA检测剂包含用于检测人体生物样品中的3种circRNA的一种或更多种检测剂，其中所述3种circRNA分别包含与SEQ-ID.3至5之一的序列具有至少95％同一性的序列。6.权利要求1至5中任一项所述的用途，其中所述人体生物样品包括肠道活检组织、粪便和血液样品。7.权利要求1至5中任一项所述的用途，其中通过以下方法对circRNA检测进行评价：对每种所检测的circRNA，将表达阳性记1分，表达阴性记0分，将总和作为circRNA评分；并且以circRNA评分＞0.5或＞1.5作为将对象诊断为患有或有风险患有结直肠癌的诊断界点。8.microRNA检测剂在制备用于结直肠癌筛查诊断的试剂中的用途，所述microRNA检测剂包含用于检测人体生物样品中的一种或更多种microRNA的一种或更多种检测剂，其中所述一种或更多种microRNA分别包含与SEQ-ID.6至7之一的序列具有至少95％同一性的序列，并且所述一种或更多种microRNA的存在提示所述样品中存在癌细胞。9.权利要求8所述的用途，其中所述microRNA检测剂包含用于检测1...

【专利技术属性】
技术研发人员：林海，王义刚，
申请(专利权)人：艾尔顿浙江生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33