厚叶南五味子逆转肝纤维化活性部位的体外筛选及其化学成分分析制造技术

本发明专利技术公开了一种瑶药厚叶南五味子逆转肝纤维化活性部位的体外筛选及其化学成分分析的方法，本发明专利技术是将厚叶南五味子经天然药物化学方法提取得到石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水层共4个溶剂提取物，采用CCK‑8法检测不同溶剂提取物对大鼠肝星状细胞HSC‑T6的增殖作用、ELISA法检测不同溶剂提取物对细胞外基质成分的影响，从中筛选出逆转肝纤维化活性最佳的部位。再利用Western blot检测最佳活性部位处理细胞后磷酸化c‑jun氨基端激酶和磷酸化丝裂原活化蛋白激酶的含量；流式细胞术检测细胞凋亡率；GC‑MS方法检测活性部位的化学成分。使用本发明专利技术的方法可以快速准确地筛选出厚叶南五味子逆转肝纤维化的活性部位并检测出活性部位的化学成分。

【技术实现步骤摘要】
厚叶南五味子逆转肝纤维化活性部位的体外筛选及其化学成分分析
本专利技术涉及中药研究分析
，具体是厚叶南五味子逆转肝纤维化活性部位的体外筛选及其化学成分分析的方法。
技术介绍
厚叶南五味子Kadsuracoccinea(Lem.)A.C.Smith是木兰科南五味子属植物，别名黑老虎、大钻、冷饭团，通常以藤茎入药，其性温，味辛、微苦，具有行气止痛、祛风活络、散瘀消肿的功效，瑶族民间常用于治疗肝炎、肝纤维化、肝硬化等肝脏疾病。本专利技术人前期研究也发现厚叶南五味子对四氯化碳、D-氨基半乳糖所致小鼠肝损伤具有明显的保护作用。肝纤维化（Hepaticfibrosis）是临床上常见的一种脏器病理变化，它是指肝脏因各种致病因素侵袭引发损害和炎症反应，修复过程中组织修复失控，导致肝细胞外基质（Extracellularmatrix,ECM）异常增多和过度沉积，最终致肝脏的结构和功能发生异常改变。大量研究表明，肝纤维化是能够逆转并恢复到组织学正常细胞的，有效控制基础疾病和抗肝纤维化治疗对其治疗有重要意义。肝纤维化的发生发展过程中，公认的核心环节是肝星状细胞（Hepaticstellatecell本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.厚叶南五味子逆转肝纤维化活性部位体外筛选的方法，其特征在于，所述体外筛选过程包括以下步骤：（1）厚叶南五味子提取物的制备：1）将干燥厚叶南五味子药材粉碎，用体积浓度为60‑80%的乙醇加热回流提取3次，提取液减压浓缩，回收溶剂至浸膏，加适量水混悬；2）将上述所得物根据极性依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇各萃取3次，得到石油醚萃取液、乙酸乙酯萃取液、正丁醇萃取液和水层；3）将各萃取液及水层分别用旋转蒸发仪回收溶剂，挥干，真空干燥，得到厚叶南五味子的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、水部位，称重备用；（2）采用CCK‑8法检测厚叶南五味子的不同溶剂提取物对大鼠肝星状细胞HSC‑T6的增殖作用：1)取对数...

【技术特征摘要】
1.厚叶南五味子逆转肝纤维化活性部位体外筛选的方法，其特征在于，所述体外筛选过程包括以下步骤：（1）厚叶南五味子提取物的制备：1）将干燥厚叶南五味子药材粉碎，用体积浓度为60-80%的乙醇加热回流提取3次，提取液减压浓缩，回收溶剂至浸膏，加适量水混悬；2）将上述所得物根据极性依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇各萃取3次，得到石油醚萃取液、乙酸乙酯萃取液、正丁醇萃取液和水层；3）将各萃取液及水层分别用旋转蒸发仪回收溶剂，挥干，真空干燥，得到厚叶南五味子的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、水部位，称重备用；（2）采用CCK-8法检测厚叶南五味子的不同溶剂提取物对大鼠肝星状细胞HSC-T6的增殖作用：1)取对数生长期的HSC-T6细胞，调整细胞数为5×105个/mL，接种于96孔板中，每孔100μL细胞悬液，培养24h；2)只加培养液设立空白对照组，加含0.5%DMSO的培养液作为溶剂对照组，设置不同浓度提取部位组：石油醚部位浓度为：10、20、30、40、50μg/mL，乙酸乙酯部位浓度为：40、80、120、160、200μg/mL，正丁醇和水部位的浓度均为：100、200、400、500、600μg/mL；3）每个浓度设4个复孔，继续孵育24h，每孔加入10μLCCK-8溶液，继续孵育2h；4）用酶标仪在450nm处测定各孔吸光度OD值，计算抑制率及半数抑制浓度IC50，抑制率的计算公式：抑制率=1-（实验组OD值／对照组OD值)×100%；半数抑制浓度IC50由电脑根据图像相关数据计算得到；5）确定各部位对HSC-T6X细胞的抑制率等于20%时对应的浓度；（3）采用ELISA法检测不同溶剂提取物对细胞外基质成分的影响：1）取对数生长期的HSC-T6细胞按2×105接种于24孔板中，培养24h；2）加入含不同浓度提取部位的培养基预处理4h；其不同浓度提取部位是在小于上述抑制率小于20%所对应的浓度下，每个提取部位分别设定3-5个浓度值；3）各加入200μmol/L乙醛继续培养72h；4）收集培养上清液，采用ELISA试剂盒方法检测大鼠型胶原、型前胶原氨基端肽、型胶原的含量。2.根据权利要求1所述厚叶南五味子逆转肝纤维化活性部位体外筛选的方法，其特征在于，所述ELISA试剂盒方法是采用固相夹心酶联免疫定量检测技术，用纯化的抗Col-I、PIIINP、Col-IV捕获抗体包被微孔内壁的表层，制成固相的载体；方法包括如下步骤：（1）取40μL待检测样品，加入10μL样品平衡液，充分混匀，于室温下平衡30min；（2）在微孔板中按每孔各50μL依次加入处理后的待测样品和各个浓度标准品；（3）每孔加入100μL辣根过氧化物酶标记抗体，充分混匀，37℃孵育60min；（4）常规法洗孔后每孔依次加入TMBⅠ50μL和TMBⅡ50μL，充分混匀，室温下避光反应2...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘瑛，柴玲，陆国寿，王丽，吕纪华，
申请(专利权)人：广西壮族自治区中医药研究院，
类型：发明
国别省市：广西,45