细胞外小泡回收方法及细胞外小泡用容器技术

本发明专利技术开发出一种用于防止以外来体为代表的细胞外小泡向器具的吸附的涂布剂。通过使用含有重均分子量为1万以上且100万以下的亲水性聚合物、且所得的涂布被膜的接触角为0度以上且30度以下的涂布剂，可以防止细胞外小泡向器具的吸附。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】细胞外小泡回收方法及细胞外小泡用容器
本专利技术涉及用于有效地回收以外来体(exosome)为代表的来自于细胞的小泡的方法及该回收中所用的容器、器具。另外，涉及用于在利用外来体检查的方法中使用的基板、流路等。
技术介绍
所谓细胞外小泡，是来自于细胞的存在于细胞外的小泡，根据其大小分类为外来体、微泡(微小小胞体，Microvesicle)、凋亡小体(apoptoticbody)。在外来体、微泡中，包含蛋白质或mRNA、miRNA等核酸，在凋亡小体中包含被片段化了的核、细胞小器官。在细胞外小泡中，由于在外来体、微泡中包含蛋白质、核酸，因此包含来自于释放它们的细胞的信息，有可能可以作为生物标记利用。特别是外来体有可能可以在诊断标记、治疗中利用，近年来受到关注。外来体是从细胞中分泌的由脂质双层膜形成的直径30～100nm的小泡体。已知从大多数的细胞中分泌外来体，在血液、唾液、尿、母乳等体液中确认了其的存在。在外来体中内包有来自于分泌它们的细胞的RNA、蛋白质，表明有可能通过在体液中循环而将信息传递至远离的细胞(非专利文献1)。利用来自于癌细胞的外来体中所含的核酸、蛋白质，可显示出癌的发展得到促进的可能性，此外该情况还表明使用了外来体的癌诊断系统的可能性(非专利文献2)。如上所述，已明确内包于外来体中的蛋白质、核酸根据分泌它们的细胞种类而不同。因此，来自于外来体的核酸、蛋白质作为诊断标记而言有用。另外，由于外来体还包含于唾液、尿中，因此如果可以确立使用了外来体的精度高的检查方法，就可以作为非侵入性诊断方法。此外，还进行过通过使用外来体的信息传递功能而将从健康的细胞采集回收的外来体用于受到伤害的细胞、患病细胞的恢复的尝试(专利文献1)。为了从唾液等少量的试样中纯化外来体、或出于治疗目的而纯化大量的外来体，需要回收率良好地纯化的方法。以往作为纯化外来体的方法，公开过利用离心分离、色谱柱进行分离的方法(专利文献2、3)。其中使用了超速离心的离心分离法是经过确立的回收技术，是在外来体的形状维持性这一点上优异的技术。例如，如果是从细胞的培养上清液中回收外来体的情况，则可以在将包含外来体的培养基利用低速离心除去细胞的碎片等后，利用2小时左右的超速离心将外来体以颗粒的形式回收。使如此得到的外来体再分散于PBS等缓冲液中，然后进行纯化、或者直接用于检查、研究等分析中。现有技术文献专利文献专利文献1：日本特表2014－507140号公报专利文献2：日本特表2003-531864号公报专利文献3：日本特表2002－535665号公报专利文献4：日本特开平7－83923号公报专利文献5：国际公开第2005/001019号非专利文献非专利文献1：Valadi，H.等，2007，Nat.CellBiol.，Vol.9，p.654-659.非专利文献2：Skog，J.等，2008，Nat.CellBiol.，Vol.10，pp.1470-1476.
技术实现思路
专利技术所要解决的问题然而，在上述的借助超速离心的回收方法中，外来体非特异性地吸附于所使用的回收容器的塑料表面，无法得到稳定的回收率，每一次操作时回收率都会降低成为问题。特别是，在进行定量分析时，向纯化中所用的容器、分析器具的表面的吸附不仅对分析的效率产生影响，对分析结果也产生影响。然而，迄今为止还没有开发出防止外来体等细胞外小泡的吸附的有效的方法。以往，公开过利用亲水性聚合物防止作为来源于生物体的物质的蛋白质、细胞向容器非特异性吸附的方法(专利文献4、5)。专利文献4中公开过，通过用包含2－甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱聚合物、或含有2－甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱的成分的共聚物的PBS溶液涂布聚苯乙烯制的容器，可以防止蛋白质的吸附。专利文献5中公开过，通过使用含有磷酰胆碱类似基团的化合物包覆培养容器，可以防止ES细胞向培养容器上的粘附，能够有效地形成胚状体。然而，专利文献4是专门化于蛋白质的方法，虽然在外来体等的表面表露出蛋白质，但是很难完全防止由脂质双层膜形成的细胞外小泡的吸附。另外，专利文献5的方法是防止由脂质双层膜形成的细胞的吸附的方法，但是由于细胞与细胞外小泡、特别是外来体的大小完全不同，因此向容器的吸附的程度大不相同，无法完全防止外来体向容器的吸附。本专利技术的课题在于，提供一种涂布剂，其用于在纯化以外来体为代表的来自于细胞的小泡时，防止来自于细胞的小泡向离心管等纯化中使用的容器、吸移管头等器具的吸附，实现回收率的提高。另外，本专利技术的课题在于，提供一种涂布剂，其不仅可以在纯化的过程中使用，而且通过涂布于外来体分析中所用的基板、流路等，可以提高外来体分析的精度。此外，本专利技术的课题在于，提供利用这些涂布剂涂布了的容器或吸移管头、基板等分析器具。用于解决问题的方法本专利技术涉及以下的涂布剂、器具、纯化方法、分析方法。(1)一种用于防止细胞外小泡吸附的涂布剂，其含有重均分子量为1万以上且100万以下的亲水性聚合物，且所得的涂布被膜的接触角为0度以上且30度以下。(2)根据(1)记载的涂布剂，其中，所述亲水性聚合物包含选自2－甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱、乙烯醇、乙烯基吡咯烷酮、甲氧基烷撑二醇单甲基丙烯酸酯或甲基丙烯酸2－羟基乙酯中的一种以上的亲水性单体。(3)根据(2)记载的涂布剂，其中，构成所述亲水性聚合物的所述亲水性单体为2－甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱，所述亲水性聚合物是含有30摩尔％以上且50摩尔％以下的基于2－甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱的构成单元、且剩余包含含有疏水性基团的单体的共聚物。(4)一种器具，其被涂布以(1)～(3)中任一项记载的涂布剂。(5)一种细胞外小泡的纯化和/或分析方法，其特征在于，使用(4)记载的器具。附图说明图1是表示基于涂布剂的有无的外来体回收量的图。图2是表示基于涂布剂的种类的外来体回收量的图。图3是表示利用粒子数研究基于涂布剂的外来体回收量的结果的图。图4A是表示利用粒子数研究基于涂布剂的外来体回收量的结果的图，图4B是表示利用蛋白印迹法研究基于涂布剂的外来体回收量的结果的图。图5A是表示利用粒子数研究基于涂布剂的膜厚的外来体回收量的结果的图，图5B是表示利用蛋白印迹法研究基于涂布剂的膜厚的外来体回收量的结果的图。图5C是对回收样品、吸附样品进行电泳、并利用银染色进行了分析的图。具体实施方式本专利技术中所谓细胞外小泡，是指来自于细胞的小泡，具体而言，是指外来体、微泡、凋亡小体。以下的实施例中以外来体为中心进行记载，然而当然也可以应用于外来体以外的细胞外小泡。另外，通过将本专利技术的涂布剂涂布于离心管、试管、吸移管头等在纯化外来体等细胞外小泡时使用的器具，可以防止其吸附，提高回收率。另外，通过涂布于微珠、微量滴定板、载玻片、微型全分析系统、芯片上实验室等该领域中所用的分析器具、分析设备，可以防止非特异吸附，提高分析精度。无论是何种材质的器具，都可以涂布本专利技术的涂布剂。例如常用作离心管的聚碳酸酯、聚丙烯、异质同晶聚合物(ポリアロマー)、或用作分析器具的基材的氯乙烯、聚苯乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、硅、亲水性聚二甲基硅氧烷、疏水性聚二甲基硅氧烷、玻璃、不锈钢或铝等金属也可以通过利用本专利技术的涂布剂涂布，来防止外来体等细胞外小泡的吸附。利用本专利技术的涂布剂得到的涂布被膜的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于防止细胞外小泡吸附的涂布剂，其含有重均分子量为1万以上且100万以下的亲水性聚合物，所得的涂布被膜的接触角为0度以上且30度以下。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.05.24 JP 2016-1030911.一种用于防止细胞外小泡吸附的涂布剂，其含有重均分子量为1万以上且100万以下的亲水性聚合物，所得的涂布被膜的接触角为0度以上且30度以下。2.根据权利要求1所述的涂布剂，其中，所述亲水性聚合物包含选自2－甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱、乙烯醇、乙烯基吡咯烷酮、甲氧基烷撑二醇单甲基丙烯酸酯或甲基丙烯酸2－羟基乙酯...

【专利技术属性】
技术研发人员：芝清隆，坂元伸行，野田朋澄，山田智，
申请(专利权)人：公益财团法人癌研究会，日油株式会社，
类型：发明
国别省市：日本,JP