本发明专利技术涉及物种鉴定领域，提供一种用于鉴别美洲大蠊的试剂盒，该试剂盒包括阳性对照、正反向引物、PCR反应混合液以及蒸馏水，阳性对照采用如SEQ ID NO.1的DNA条形码标准检测片段COⅡ，正反向引物的序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。在本发明专利技术中，来源于美洲大蠊的COⅡ基因片段(SEQ ID NO.1)在美洲大蠊物种的同源性在98～100％，而与非美洲大蠊的基因同源性显著降低，进而通过引物设计和PCR扩增可准确区分美洲大蠊与其他类似品种。本发明专利技术提供的试剂盒可用于鉴别粉末状或炮制品的美洲大蠊，检测范围更广，检测准确度更高，鉴别所需时间短。
A DNA Bar Code Standard Detection Fragment CO II for Identifying Periplaneta Americana, a Kit and Its Application
The invention relates to the field of species identification, and provides a kit for identifying Periplaneta americana. The kit includes positive control, positive and negative primers, mixed solution of PCR reaction and distilled water. The positive control uses DNA barcode standard detection fragment CO II such as SEQ ID NO.1, and the sequence of positive and negative primers such as SEQ ID NO.2 and SEQ ID NO.3. In the present invention, the homology of CO II gene fragment (SEQ ID NO.1) from Periplaneta Americana is 98-100% in the species of Periplaneta americana, while the homology with non-Periplaneta Americana is significantly reduced. Further, the primer design and PCR amplification can accurately distinguish Periplaneta Americana from other similar species. The kit provided by the invention can be used to identify Periplaneta Americana in powder or processed products, with wider detection range, higher detection accuracy and shorter identification time.
【技术实现步骤摘要】
一种鉴别美洲大蠊的DNA条形码标准检测片段COⅡ、试剂盒及其使用方法
本专利技术涉及物种鉴定
，具体涉及一种鉴别美洲大蠊的试剂盒及其使用方法。
技术介绍
美洲大蠊(PeriplanetaamericanaLinn.)是长期应用于民间的动物药药材，常以干燥或鲜成虫入药，主治儿童疳积、扁桃腺炎、身体包块、痈疮肿痛和蜈蚣叮咬等。近年来，研究表明美洲大蠊作为昆虫药物的临床应用记录显示，其具有抗肿瘤、治疗心血管疾病、促进组织修复、抗菌、抗病毒、抗氧化、增强免疫等药理作用，美洲大蠊药物制剂在临床上的应用也越来越广泛，而对美洲大蠊药材的真伪鉴定是入药及进行药理学研究的基础。目前在国际范围内对昆虫的种类鉴定主要是依据成虫的形态学特征，而在中国的药材市场上，美洲大蠊药材通常以粉末或炮制品等形式入药。由于传统的性状鉴别缺乏准确的内部解剖特征或者是在贮藏、加工炮制过程中形态被严重破坏，因此基于形态结构细微差别的归类描述稳定性差、可信度低，导致药用美洲大蠊的鉴定存在很大困难。同时，由于传统的性状鉴别无法准确、快速的鉴定药材市场贩售的美洲大蠊药材，导致有部分伪品(例如药效不及美洲大蠊的澳洲大蠊、德国小蠊、甚或其它科属的昆虫)在市场内流通，市场较为混乱。常规的分类学鉴别方法需要将美洲大蠊幼虫需要培养为成虫才能鉴定，耗时较长；对与残缺不全的昆虫药材炮制品、虫体粉末则基本上不能检测；以传统分类学方法鉴定美洲大蠊要求掌握昆虫，尤其是蜚蠊属昆虫形态分类学的专业技术人员才能对美洲大蠊成虫进行药材鉴定。因此，该昆虫药物的药材鉴定及原料药饮片的质量控制等均亟需寻求一种新的方法，以弥补传统分类学方法的缺陷及不足。DNA条形码技术(DNABarcoding)是对一个标准化、较短的基因片段的序列变异进行分析的一种分子技术，具有原理简单、操作便捷、可重复性强、准确率高、利于标准化等优点，是物种鉴定、发现隐存种和研究生物遗传多样性、生物系统进化、分类学和生物保护等的有力工具。随着分子生物技术和计算机技术的发展，DNA条形码这一新兴的技术己经得到了相关领域的越来越多科学家的广泛关注。近几年来，DNA条形码技术已被证明是一个行之有效的分子生物鉴定手段，可对传统形态鉴定方法作强有力的补充。但是，目前并没有一种准确性高的有效DNA条形码鉴别方法出现。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供了一种用于鉴别美洲大蠊的DNA条形码标准检测片段COⅡ，该片段来源于美洲大蠊COⅡ基因，以该片段为目的基因可以有效区分美洲大蠊与其他类似品种。本专利技术为此还提供了能够扩增上述DNA条形码标准检测片段COⅡ的引物对，使DNA条形码标准检测片段COⅡ能够被有效扩增。本专利技术还提供了一种以所述DNA条形码标准检测片段COⅡ为目的基因的鉴别试剂盒，采用该试剂盒对美洲大蠊鉴别的准确性高。本专利技术还提供了一种上述试剂盒的使用方法，利用该试剂盒对美洲大蠊鉴别所需时间短，有利于对昆虫原料的快速鉴定。为了解决上述问题，本专利技术提供了以下技术方案：本专利技术提供了一种用于鉴别美洲大蠊的DNA条形码标准检测片段COⅡ，所述标准检测片段的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术提供了一种用于鉴别美洲大蠊的引物对，所述引物对用于扩增上述技术方案所述DNA条形码标准检测片段COⅡ，所述引物对中，正向引物的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，反向引物的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。本专利技术提供了一种用于鉴别美洲大蠊的试剂盒，包括上述技术方案所述的引物对、PCR反应混合液；所述PCR反应混合液包括：0.1UTaq聚合酶、500μmol/LdNTP、20mmol/L且pH＝8.3的Tris-HCl、100mmol/L氯化钾以及3μmol/L的氯化镁。优选的，所述试剂盒还包括阳性对照，所述阳性对照为前述技术方案所述DNA条形码标准检测片段COⅡ或美洲大蠊成虫或美洲大蠊成虫。优选的，所述引物对中正反向引物的浓度均为10μmol/L。本专利技术还提供一种利用上述技术方案所述试剂盒鉴别美洲大蠊的方法，包括以下步骤：提取待测样品的DNA，以待测样品的DNA、阳性对照DNA作为模板DNA，分别与引物对、PCR反应混合液和蒸馏水混合得到样品扩增体系和阳性扩增体系，分别进行PCR扩增；将得到的样品PCR扩增产物和阳性PCR扩增产物分别以琼脂糖凝胶电泳分离，当待测样品的PCR扩增产物的电泳条带位于250～500bp条带位置并且与阳性对照的PCR扩增产物的电泳条带位置相同，则判断待测样品属于美洲大蠊。优选的，所述待测样品包括待鉴定的昆虫鲜品或干品。优选的，所述PCR扩增的反应体系共50μL：模板DNA2μL、正反向引物各2μL、PCR反应混合液25μL以及蒸馏水19μL。优选的，所述PCR扩增的反应程序为：94℃预变性3.5min，依次进行94℃35s、49℃35s、72℃45s的循环33个，72℃延伸5min。与现有技术相比，本专利技术提供的技术方案具有以下优点：本专利技术提供了一种用于鉴别美洲大蠊的DNA条形码标准检测片段COⅡ，该核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术提供的美洲大蠊的COⅡ(线粒体细胞色素氧化酶C亚基Ⅱ)基因片段(即SEQIDNO.1)，该片段与美洲大蠊物种的同源性在98～100％，而与其他非美洲大蠊的COⅡ基因同源性显著降低(不超过95％)。本专利技术选择具有高度保守的线粒体DNACOⅡ基因作为DNA条形码标准检测片段，本专利技术发现的SEQIDNO.2所示核苷酸序列在美洲大蠊所属蜚蠊科的种间和种内间存在较大差异，能够有效区分美洲大蠊与其近似种的昆虫。针对本专利技术提供的DNA条形码标准检测片段COⅡ进行引物设计和PCR扩增可准确区分美洲大蠊与其他类似品种。本专利技术提供的引物对用于扩增上述DNA条形码标准检测片段COⅡ，利用该引物对可以特异性扩增所述DNA条形码标准检测片段COⅡ，特异性强，灵敏度高。本专利技术还提供了一种用于鉴别美洲大蠊的试剂盒，该试剂盒包括上述技术方案所述引物对和PCR反应混合液。本专利技术提供的试剂盒可用于鉴别粉末状或炮制品的美洲大蠊，不必拘泥于待测样本的形态，相对于传统美洲大蠊方法的检测范围更广，检测准确度更高。本专利技术还提供了一种利用上述试剂盒对美洲大蠊进行鉴别的方法，提取待测样品的DNA，以待测样品的DNA、阳性对照DNA作为模板DNA，分别与引物对、PCR反应混合液以及蒸馏水混合进行PCR扩增；将得到的样品PCR扩增产物和阳性PCR扩增产物分别以琼脂糖凝胶电泳分离，当待测样品的PCR扩增产物的电泳条带位于250～500bp条带位置并且与阳性对照的PCR扩增产物的电泳条带位置相同，则判断待测样品属于美洲大蠊。采用本专利技术提供的方法进行美洲大蠊鉴别仅需100-150min即可完成(待测样品预处理时间另计)，鉴别时间短、速度快，检测结果准确。附图说明图1为实施例3中美洲大蠊实验室种群COⅡ基因基因的琼脂糖凝胶电泳图；图2为实施例4中不同种属的昆虫样本的琼脂糖凝胶电泳图；图3为实施例5中不同地理来源的美洲大蠊样本的琼脂糖凝胶电泳图。图4为实施例6中不同形态的美洲大蠊样本的琼脂糖凝胶电泳图；具体实施方式本专利技术提供了一种用于鉴别美洲大蠊的DNA条形码标准检测片段COⅡ，所述标准检测片段的核苷酸序列如SEQIDNO.1所本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于鉴别美洲大蠊的DNA条形码标准检测片段COⅡ，所述标准检测片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
【技术特征摘要】
1.一种用于鉴别美洲大蠊的DNA条形码标准检测片段COⅡ，所述标准检测片段的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。2.一种用于鉴别美洲大蠊的引物对，其特征在于，所述引物对用于扩增权利要求1所述DNA条形码标准检测片段COⅡ，所述引物对中，正向引物的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，反向引物的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。3.一种用于鉴别美洲大蠊的试剂盒，包括权利要求2所述的引物对、PCR反应混合液；所述PCR反应混合液包括：0.1UTaq聚合酶、500μmol/LdNTP、20mmol/L且pH＝8.3的Tris-HCl、100mmol/L氯化钾以及3μmol/L的氯化镁。4.根据权利要求3所述用于鉴别美洲大蠊的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性对照，所述阳性对照为权利要求1所述DNA条形码标准检测片段COⅡ或美洲大蠊成虫。5.根据权利要求3或4所述的用于鉴别美洲大蠊的试剂盒，其特征在于，所述引物对中正反向引物的浓度均为10μmol/L。6.一...
【专利技术属性】
技术研发人员：耿福能，巫秀美，刘彬，陈壮志，沈咏梅，马秀英，吴桃清，白丽，
申请(专利权)人：大理大学，
类型：发明
国别省市：云南,53
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