一种用于卡耶塔环孢子虫快速分型和溯源的定量PCR方法及试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种对卡耶塔环孢子虫进行快速分型和溯源的定量PCR方法，采用卡耶塔环孢子虫线粒体基因组不同拷贝间的多态性连接区域作为遗传标记，设计了特异性的定量PCR引物，包含上游引物Cyc‑Mito‑F1和下游引物Cyc‑Mito‑R1，其核苷酸序列依次如SEQ ID NO：1～2所示。本发明专利技术方法克服了现有的卡耶塔环孢子虫单位点分子诊断工具无法对该病原进行精细分型的缺点，而且扩增效率比现有的单位点分子诊断工具高；本发明专利技术采用卡耶塔环孢子虫线粒体基因组上的单个位点定量PCR和熔解曲线分析就可进行快速的基因型区分和溯源，克服了现有的卡耶塔环孢子虫多位点序列分型工具中因需要对多个位点扩增和测序所导致的分型耗时长、成本高的缺点，具有较大的应用前景。

A Quantitative PCR Method and Kit for Rapid Classification and Traceability of Cyclosporidium Cayetta

The invention discloses a quantitative PCR method for rapid typing and traceability of Cyclosporidium kayetta. Using polymorphic linkage regions between different copies of the mitochondrial genome of Cyclosporidium kayetta as genetic markers, specific quantitative PCR primers are designed, including upstream primers Cyc Mito F1 and downstream primers Cyc Mito R1, whose nucleotide sequences are sequenced as SEQ ID NO:1. As shown in ~2. The method overcomes the disadvantage that the existing molecular diagnostic tool for unit point of Cyclosporidium kayetta can not subtype the pathogen precisely, and the amplification efficiency is higher than that of the existing molecular diagnostic tool for unit point. The method adopts quantitative PCR and melting curve analysis of a single site on the mitochondrial genome of Cyclosporidium kayetta to quickly distinguish and trace the genotype and overcome the disadvantage. The disadvantage of the existing multi-locus sequence typing tools for Cyclosporidium cayetta is that the need for amplification and sequencing of multiple loci results in long time-consuming and high cost of typing, which has great application prospects.

【技术实现步骤摘要】
一种用于卡耶塔环孢子虫快速分型和溯源的定量PCR方法及试剂盒
本专利技术属于分子生物学
，更具体地，涉及一种用于卡耶塔环孢子虫快速分型和溯源的定量PCR方法及试剂盒。
技术介绍
卡耶塔环孢子虫是一种重要的食源性传播病原，该病原进入人体后主要引起以腹泻为主的环孢子虫病，尤其在儿童和免疫缺陷病病人中常会造成持续性腹泻。环孢子虫病最早发现于秘鲁、危地马拉和尼泊尔等发展中国家，并且在这些国家呈地方性流行。但近年来，随着旅游业和食品供应的不断全球化，环孢子虫病传播到非环孢子虫病流行地的机会急剧增加。在过去的20年中，北美地区几乎每年都会出现大规模的环孢子虫病暴发，而且这些暴发主要与从环孢子虫病流行地进口的新鲜果蔬有关，因此卡耶塔环孢子虫已对公共卫生安全和食品安全造成了巨大威胁。我国对环孢子虫病的研究起步相对较晚，虽然目前还没有环孢子虫病暴发报道，但我国作为进口水果的高消费国家，每年从包括危地马拉、秘鲁等环孢子虫病流行地进口大量的新鲜果蔬(在2014～2016年间，我国平均每年进口水果总量高达350余万吨)，因此也存在环孢子虫病大规模暴发的风险。所以，亟需可精细区分卡耶塔环孢子虫的分型工具，以确定暴发的发生以及污染来源。现有的卡耶塔环孢子虫单位点分子诊断工具无法用于该病原的基因型区分。在卡耶塔环孢子虫全基因组测序完成之前，针对该病原的分子诊断工具几乎都是基于该病原核基因组的核糖体小亚基RNA(SmallSubunitribosomalRNA，SSUrRNA)基因、70kDa热休克蛋白(70kDaHeatShockProtein，HSP70)和内转录间隔区(InternalTranscribedSpacer，ITS)建立的，其中前两者在该病原中高度保守，而ITS区域在同一虫株的不同拷贝之间就存在明显的序列差异。因此，基于这些位点建立的单位点分子诊断工具均无法用于该病原的基因型区分。而卡耶塔环孢子虫全基因组测序的完成使该病原高分辨率分型工具的建立成为可能。最近，中国源和美国源的卡耶塔环孢子虫虫株的全基因组测序相继完成，基于获得的全基因组序列，已建立了一种具有高分辨率的多位点序列分型工具(MultilocusSequenceTyping，MLST)，但该工具需通过对多个位点进行扩增和测序来实现分型，所以检测成本较高，且耗时耗力。定量PCR(quantitativePCR，qPCR)是目前应用最广泛的分子诊断工具之一，该方法通常采用荧光染料对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，不仅检测方法简单，且成本低。在PCR反应中，荧光染料特异性地结合在双链DNA上，随着PCR反应的进行，双链DNA反应产物不断增加，荧光信号强度也等比例增加，通过对PCR反应中每一个扩增循环产物的荧光信号进行实时检测，可实现对起始模板定性及定量分析。此外，扩增结束后逐渐增加温度使双链DNA逐步解链，荧光染料会从解链的DNA分子上释放，荧光强度降低，在解链过程中熔解温度将会出现一个特征峰值Tm(DNA双链解链50％的温度)，并且若起始模板的DNA序列、长度、GC含量之间存在差异，其对应产生的Tm值也会有所不同。因此，根据熔解曲线的峰形和Tm值即可以快速、准确地对待测样品进行序列多态性分析和基因型鉴定。作为一种快速、灵敏且经济的诊断技术，qPCR结合熔解曲线分析已被广泛应用于突变分析和基因分型。目前，还未见有采用qPCR对卡耶塔环孢子虫进行快速分型和溯源的方法。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是克服现有卡耶塔环孢子虫分子诊断工具无法对该病原进行快速精细分型的缺点，建立一种可用于该病原快速分型和溯源的qPCR方法，解决目前无法对环孢子虫病暴发进行快速鉴定和污染源追踪的问题。本专利技术的第一个目的是提供一种用于卡耶塔环孢子虫快速检测和分型的qPCR引物。本专利技术的第二个目的是提供一种用于卡耶塔环孢子虫快速分型和溯源的qPCR方法。本专利技术的第三个目的是提供一种用于卡耶塔环孢子虫快速分型和溯源的试剂盒。本专利技术的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：一种用于卡耶塔环孢子虫快速检测和分型的PCR引物，所述引物扩增的片段包含卡耶塔环孢子虫线粒体基因组不同拷贝之间的多态性连接区域。本专利技术通过全基因组测序，发现卡耶塔环孢子虫与其它真核寄生虫类似，具有完整的线粒体基因组。与核基因组相比，线粒体基因组进化速度更快，因此基于该基因组建立的分型工具一般具有较高的分辨率。而且，作为母系遗传的基因组，线粒体基因组上不存在遗传重组，因此该基因组上的序列通常会被用作病原地理来源追踪的遗传标记。此外，通过全基因组测序发现，每个卡耶塔环孢子虫细胞中有大约500个线粒体基因组拷贝，因此基于线粒体基因组建立的分子诊断工具应比基于核基因组建立的分子诊断工具具有更高的扩增效率和检测灵敏度。更重要的是，通过比对中国源和美国源的卡耶塔环孢子虫线粒体基因组，发现线粒体基因组不同拷贝之间的连接区域中至少包含一个单核苷酸突变位点和一个7-bp的多核苷酸突变序列。因此，卡耶塔环孢子虫的线粒体基因组不同拷贝之间的多态性连接区域非常适用于建立该病原的基因型区分和溯源工具。本专利技术以卡耶塔环孢子虫线粒体基因组不同拷贝连接处的序列多态性片段作为该病原基因型区分的遗传标记，进而根据该多态性区域前后的保守序列区设计qPCR引物，使引物扩增的片段中包含卡耶塔环孢子虫线粒体基因组不同拷贝之间的多态性连接区域。优选地，所述qPCR引物退火温度为55～65℃；上、下游引物的Tm值相差不超过2℃；PCR产物大小为80～500bp；引物长度为18～28bp；GC含量为40～60％。优选地，所述qPCR引物包含上游引物Cyc-Mito-F1和下游引物Cyc-Mito-R1，其核苷酸序列依次如SEQIDNO：1～2所示；Cyc-Mito-F1：5′-GAGCGGTGTGTTTAAGGCAA-3′(SEQIDNO：1)；Cyc-Mito-R1：5′-CTGCTGGGACTTTGTCTCTTGT-3′(SEQIDNO：2)。上述引物Cyc-Mito-F1和Cyc-Mito-R1分别位于卡耶塔环孢子虫线粒体基因组SSUrRNA基因的SSU/11区域和SSU/4区域，其扩增片段位于卡耶塔环孢子虫线粒体基因组不同拷贝之间的连接区域，长度为357bp左右。本专利技术还请求保护上述qPCR引物在卡耶塔环孢子虫快速分型和溯源检测和/或在制备用于卡耶塔环孢子虫快速分型和溯源的检测试剂盒中的应用。一种用于卡耶塔环孢子虫快速分型和溯源的qPCR方法，包括如下步骤：S1.从待测粪便样品中提取DNA；S2.以S1所述DNA为模板，用上述qPCR引物进行qPCR扩增；S3.对S2的qPCR扩增产物进行扩增曲线和熔解曲线分析，根据熔解曲线对应的Tm值鉴定待测样品是否属于同一基因型，进一步根据其基因型进行溯源。优选地，所述qPCR扩增的反应体系为包含以下终浓度的试剂：dNTPs200μM，MgCl23mM，上下游引物各500nM，1×GeneAmpPCRbuffer，1×EvaGreen荧光染料，DNA聚合酶2.5U，DNA模板1μL，BSA400ng/μL。优选地，所述qPCR反应程序为：95℃3min；95℃5s，58℃15s，72℃15s，共50本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于卡耶塔环孢子虫快速分型和溯源的PCR引物，其特征在于，所述引物扩增的片段包含卡耶塔环孢子虫线粒体基因组不同拷贝之间的多态性连接区域。

【技术特征摘要】
1.一种用于卡耶塔环孢子虫快速分型和溯源的PCR引物，其特征在于，所述引物扩增的片段包含卡耶塔环孢子虫线粒体基因组不同拷贝之间的多态性连接区域。2.根据权利要求1所述的PCR引物，其特征在于，包括上游引物Cyc-Mito-F1和下游引物Cyc-Mito-R1，其核苷酸序列依次如SEQIDNO：1～2所示。3.权利要求1或2所述的PCR引物在卡耶塔环孢子虫快速检测、分型和溯源和/或在制备用于卡耶塔环孢子虫快速检测、分型和溯源的剂盒中的应用。4.一种用于卡耶塔环孢子虫快速检测、分型和溯源的定量PCR方法，其特征在于，包括如下步骤：S1.从待测粪便样品中提取DNA；S2.以S1所述DNA为模板，用权利要求1或2所述PCR引物进行定量PCR扩增；S3.对S2的定量PCR扩增产物进行扩增曲线和熔解曲线分析，以鉴定待测样品的基因型，进而推测其地理来源。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述定量PCR扩增的反应...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯耀宇，郭亚琼，李娜，王元非，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东,44