一种重组大肠杆菌生产磷脂酶D的方法技术

本发明专利技术公开了一种重组大肠杆菌生产磷脂酶D的方法，将磷脂酶D基因置于严谨型启动子控制下，在表达质粒中插入pSC101的par区域，同时使用大肠杆菌recA突变株保持质粒的遗传稳定，生长期富集含质粒的细胞培养至高密度，诱导期饱和诱导，同时降低温度和施加碱金属盐胁迫，缓解PLD对宿主的细胞毒性，抑制细胞裂解，延长PLD的合成时间，从而提高PLD的表达。

A Method for Producing Phospholipase D by Recombinant Escherichia coli

The invention discloses a method for producing phospholipase D by recombinant Escherichia coli. The phospholipase D gene is placed under the control of a rigorous promoter and inserted into the par region of pSC101 in the expression plasmid. At the same time, the recA mutant strain of Escherichia coli is used to maintain the genetic stability of the plasmid, enrich the plasmid-containing cells in the growth period to high density, saturate induction in the induction period, and reduce temperature and apply alkali gold. Salt stress can alleviate the cytotoxicity of PLD to host cells, inhibit cell lysis and prolong the synthesis time of PLD, thereby increasing the expression of PLD.

【技术实现步骤摘要】
一种重组大肠杆菌生产磷脂酶D的方法
本专利技术属于基因工程和微生物发酵
，具体涉及一种重组大肠杆菌生产磷脂酶D的方法。
技术介绍
磷脂酶D(EC3.1.4.4，PLD)，以磷脂为底物，作用于磷酸二酯键，根据受体的不同(水和醇)，发生水解反应和转磷脂酰反应。其中，通过转磷脂酰反应，底物磷脂中可以引入各种各样的醇基，生成多种生物活性和药用价值的磷脂，被广泛用于食品和制药行业。例如当底物为磷脂酰胆碱(PC)，受体为丝氨酸、甘油和乙醇胺时，PLD分别转化PC为磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰甘油(PG)和磷脂酰乙醇胺(PE)(andIwasaki2013)。其中，随着人口老龄化到来，PS作为脑健康营养补充剂，受到持续的关注，并相继被美国FDA、日本HBM和中国国家卫生计生委所认证。相较于提取自牛脑和植物的PS，以大豆PC为底物通过PLD生物酶法制备的PS，避免了食品安全和植物源含量低的问题(Moréetal.2014)。进一步，一些新的结构和功能磷脂，通过PLD转磷脂酰反应被合成出来，例如，磷脂酰鲨肝醇(Arranz-Martínezetal.2017)、磷脂酰葡萄糖(Songetal.2本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组大肠杆菌生产磷脂酶D的方法，其特征在于：包括：1)以含有如SEQ ID No.1所示的pSC101的par区域序列的质粒pUC57‑par为模板，扩增par序列；以含有阿拉伯糖启动子PBAD的质粒pBADK为模板，扩增质粒pBADK骨架；以上述扩增得到的par序列和pBADK骨架分别作为引物和模板，扩增并转化，得到载体pBADKP；采用含有如SEQ ID No.2所示的密码子优化的Streptomyces antibioticus PLD基因序列的质粒pUC57‑PLD与所述载体pBADKP，通过Nco I和Xba I双酶切，连接并转化至大肠杆菌recA‑缺陷株，得到含有pBADK...

【技术特征摘要】
1.一种重组大肠杆菌生产磷脂酶D的方法，其特征在于：包括：1)以含有如SEQIDNo.1所示的pSC101的par区域序列的质粒pUC57-par为模板，扩增par序列；以含有阿拉伯糖启动子PBAD的质粒pBADK为模板，扩增质粒pBADK骨架；以上述扩增得到的par序列和pBADK骨架分别作为引物和模板，扩增并转化，得到载体pBADKP；采用含有如SEQIDNo.2所示的密码子优化的StreptomycesantibioticusPLD基因序列的质粒pUC57-PLD与所述载体pBADKP，通过NcoI和XbaI双酶切，连接并转化至大肠杆菌recA-缺陷株，得到含有pBADKP-PLD的重组菌；2)培养步骤1)得到的含有pBADKP-PLD的重组菌，培养至高密度；然后补充营养，饱和诱导，调节温度为16～22℃，添加碱金属盐至浓度为0.05～0.75M，诱导表达得到磷脂酶D。2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌生产磷脂酶D的方法，其特征在于：所述步骤1)中，扩增par序列采用如SEQIDNo.3所示的引物1及如SEQIDNo.4所示的引物2。3.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌生产磷脂酶D的方法，其特征在于：所述步骤1)中，扩增质粒pBADK骨架采用如SEQIDNo.5所示的引物3及如S...

【专利技术属性】
技术研发人员：卢英华，熊维德，曾宪海，姚传义，沈亮，陈翠雪，
申请(专利权)人：厦门大学，
类型：发明
国别省市：福建,35