一种酶类生化试剂的纯化技术制造技术

本发明专利技术涉及一种酶类生化试剂的纯化技术，其特征在于，包括如下步骤：(1)酶类生化试剂预处理；(2)微球硅胶预处理；(3)吸附：调节酶类生化试剂滤液pH值后加入预处理后的微球硅胶，搅拌后静置吸附；(4)洗脱：用氯化钾溶液搅拌洗脱，滤出洗脱液，重复洗脱并合并洗脱液；(5)离心：将洗脱液用离心管离心除蛋白、脱盐，得到离心液；将离心液干燥后，即得到所述酶类生化试剂；本发明专利技术工艺简单，成本较低，制备获得的酶类生化试剂纯度高、活性高。

Purification of an Enzyme Biochemical Reagent

The invention relates to a purification technology of enzymatic biochemical reagents, which is characterized by the following steps: (1) pretreatment of enzymatic biochemical reagents; (2) pretreatment of microsphere silica gel; (3) adsorption: adding pretreated microsphere silica gel after adjusting the pH value of filtrate of enzymatic biochemical reagents, stirring and static adsorption after stirring; (4) elution: stirring elution with potassium chloride solution, filtering eluent, repeated elution and coalescence. And the eluent; (5) Centrifugation: centrifuge the eluent with a centrifugal tube to remove protein and desalinate, and obtain the centrifugal liquid; after drying the centrifugal liquid, the enzyme biochemical reagent is obtained; the process of the invention is simple, the cost is low, and the enzyme biochemical reagent obtained by the preparation has high purity and high activity.

【技术实现步骤摘要】
一种酶类生化试剂的纯化技术
本专利技术涉及生物学领域，具体涉及一种酶类生化试剂的纯化技术。
技术介绍
随着生命科学的发展，酶类生化试剂已发展成为化学试剂的一大类,有商品10000多种。中国销售的酶类生化试剂品种有2500种。酶类生化试剂受热、受潮、受光后易丧失活力，保存期短，因此贮运条件比较苛刻。例如，绝大多数酶试剂怕热，需在0-6℃下保存，有些作为遗传工程用的酶试剂则需在－20℃下保存。酶类生化试剂按生物体组织中所含有的或是在代谢过程中所产生的物质可分为氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸、酶、辅酶、糖类、酯类、激素等；按生物学研究的需要可分为电泳试剂、色谱试剂、免疫试剂、标记试剂、组织化学试剂等。酶类生化试剂根据用途不同对其纯度及技术均有一定的要求。例如酶试剂，有粗制酶、结晶酶、多次结晶酶以及不含某些杂酶的酶制剂等多种。酶类生化试剂有三种生产方法：①从生物体中分离、纯化；②化学合成；③发酵。对酶类生化试剂产品的技术要求有：含量、熔点、冰点、旋光度、含水量、光谱特征、折光、密度和生物活性等。各种动物器官、组织和体液中含有酶的种类和数量差别甚大。通常所含酶的总量并不很少，但每一种酶的含量却很少，常在百万分之几至百分之几。因此酶的提取、分离、纯化与确认要靠较高水平的生物化学技术。国内对酶类生化试剂的分离纯化、提取制备方法曾经用到结晶法、离子交换层析法、亲和层析法等，但都有一定弊端。即便是目前工业生产主要采用阳离子交换法，通过阳离子所述微球硅胶吸附、高盐洗脱、脱盐脱水和雾化干燥等步骤获得酶类生化试剂，但由于酶类生化试剂洗脱液溶液量大、含盐量高，常用离心设备负担重、离心膜因长时间工作易受污染，膜的使用寿命受到很大的影响；上述技术所选择的分离纯化方法、洗脱液、离心时机等条件不适宜，造成分离纯化的成本高，分离后的酶类生化试剂纯度不高，提取工艺落后使得酶类生化试剂活性损失大等问题。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了一种酶类生化试剂的纯化技术，其特征在于，包括以下步骤：(1)生物细胞预处理；a.用研钵在-5℃冷冻条件下将生物细胞研成粉末；b.对每10g步骤a处理后的生物细胞，加入0.5ml裂解液，裂解20-30分钟，将生物细胞裂解液收集到EP管中；以重量百分比计，裂解液包括0.1-0.15％的氯化钠、1.0-1.5％的EDTA、0.05-0.1％的过氧化氢和0.2-0.5％TritoAx-100；余下部分为去离子水；c.将步骤b处理好细胞悬液置于4℃下，以3000r/min转速离心5分钟；放置3-4分钟，直至细胞悬液变清，避开上层漂浮的脂质层，取上清液，得到酶类生化试剂预处理液；将酶类生化试剂搅拌均匀后，过100-150目滤网得酶类生化试剂滤液；(2)微球硅胶预处理；取微球硅胶用蒸馏水洗涤至无明显杂质并滤干，先用盐酸溶液浸泡后，再用蒸馏水冲洗得微球硅胶A；其中，微球硅胶选自聚丁二酰亚胺和3-氨基丙基硅胶制得微球中的一种；微球硅胶预处理，将微球硅胶浸泡于2-4倍微球硅胶体积的0.8-1.2moC/C盐酸溶液，浸泡时间为10-12h，用蒸馏水冲洗至流出液pH值为5.5-6.5，得微球硅胶A；再将微球硅胶A浸泡于2-4倍微球硅胶体积的0.8-1.2moC/C氢氧化钠溶液，浸泡时间为10-12h，用蒸馏水冲洗至流出液pH值为9-10，得微球硅胶B；(3)吸附；往酶类生化试剂滤液中加入步骤(2)所得微球硅胶B，搅拌混匀后静置吸附，弃去上清液，用蒸馏水洗涤，得微球硅胶C；酶类生化试剂滤液pH值为9.0-10；酶类生化试剂滤液与微球硅胶B的体积比为10：3，控制酶类生化试剂滤液pH值为8-10；(4)洗脱；向步骤(3)所得微球硅胶C中加入氯化钾溶液，搅拌洗脱，滤出洗脱液，重复洗脱合并所得洗脱液，保留滤出洗脱液后的微球硅胶；氯化钾溶液的浓度为0.5-2.5moC/C，搅拌洗脱的频率为60-100r/min，时间为45-65min；氯化钾溶液为1-1.5moC/C，搅拌洗脱时间为70-90min，氯化钾溶液的用量为步骤(1)酶类生化试剂滤液体积的0.5-1倍；滤出洗脱液后的微球硅胶作为微球硅胶A继续进行步骤(2)制备微球硅胶B；(5)离心；将步骤(4)所得洗脱液先置于截留量为70KD的离心管中，离心并取下层液；将下层液置于截留量为5KD的离心管中，离心并取上层截留液，即得到酶类生化试剂；截留量为70KD离心管的转速为5000-6000r/min时，离心时间为3-8min；截留量为5KD离心管的转速为7000-9000r/min时，离心时间为30-50min；将离心液干燥后，即得到纯化后的酶类生化试剂。本专利技术的有益成果为：本专利技术提供了一种酶类生化试剂的纯化技术，工艺简单，成本较低，制备获得的酶类生化试剂纯度高、活性高。具体实施方式为了使本专利技术所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本专利技术进行详细的说明；应当说明的是，此处所描述的具体实施例仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术，能实现同样功能的产品属于等同替换和改进，均包含在本专利技术的保护范围之内；具体方法如下：实施例：有鉴于此，本专利技术提供了一种酶类生化试剂的纯化技术，其特征在于，包括有鉴于此，本专利技术提供了一种酶类生化试剂的纯化技术，其特征在于，包括以下步骤：(1)生物细胞预处理；a.用研钵在-5℃冷冻条件下将所述生物细胞研成粉末；b.对每10g步骤a处理后的所述生物细胞，加入0.5ml裂解液，裂解20-30分钟，将所述生物细胞裂解液收集到EP管中；以重量百分比计，所述裂解液包括0.1-0.15％的氯化钠、1.0-1.5％的EDTA、0.05-0.1％的过氧化氢和0.2-0.5％TritoAx-100；余下部分为去离子水；c.将步骤b处理好细胞悬液置于4℃下，以3000r/min转速离心5分钟；放置3-4分钟，直至所述细胞悬液变清，避开上层漂浮的脂质层，取上清液，得到酶类生化试剂预处理液；将所述酶类生化试剂搅拌均匀后，过100-150目滤网得酶类生化试剂滤液；将实施例的洗脱液和离心液分别取样进行SDS-PAGE凝胶电泳实验，电泳结果表明，洗脱液和离心液均可在14.4KDa系列看见明显条带，且洗脱液在离心后可看出杂质去除效果较好，提取的酶类生化试剂纯度高。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.本专利技术涉及一种酶类生化试剂的纯化技术，其特征在于，包括以下步骤：(1)生物细胞预处理；a.用研钵在‑5℃冷冻条件下将所述生物细胞研成粉末；b.对每10g步骤a处理后的所述生物细胞，加入0.5ml裂解液，裂解20‑30分钟，将所述生物细胞裂解液收集到EP管中；以重量百分比计，所述裂解液包括0.1‑0.15％的氯化钠、1.0‑1.5％的EDTA、0.05‑0.1％的过氧化氢和0.2‑0.5％TritoAx‑100；余下部分为去离子水；c.将步骤b处理好细胞悬液置于4℃下，以3000r/min转速离心5分钟；放置3‑4分钟，直至所述细胞悬液变清，避开上层漂浮的脂质层，取上清液，得到酶类生化试剂预处理液；将所述酶类生化试剂搅拌均匀后，过100‑150目滤网得酶类生化试剂滤液；(2)所述微球硅胶预处理；取所述微球硅胶用蒸馏水洗涤至无明显杂质并滤干，先用盐酸溶液浸泡后，再用蒸馏水冲洗得所述微球硅胶A；其中，所述微球硅胶选自聚丁二酰亚胺和3‑氨基丙基硅胶制得微球中的一种；所述微球硅胶预处理，将所述微球硅胶浸泡于2‑4倍所述微球硅胶体积的0.8‑1.2moC/C盐酸溶液，浸泡时间为10‑12h，用蒸馏水冲洗至流出液pH值为5.5‑6.5，得所述微球硅胶A；再将所述微球硅胶A浸泡于2‑4倍所述微球硅胶体积的0.8‑1.2moC/C氢氧化钠溶液，浸泡时间为10‑12h，用蒸馏水冲洗至流出液pH值为9‑10，得所述微球硅胶B；(3)吸附；往所述酶类生化试剂滤液中加入步骤(2)所得所述微球硅胶B，搅拌混匀后静置吸附，弃去上清液，用蒸馏水洗涤，得所述微球硅胶C；所述酶类生化试剂滤液pH值为9.0‑10；所述酶类生化试剂滤液与所述微球硅胶B的体积比为10：3，控制所述酶类生化试剂滤液pH值为8‑10；(4)洗脱；向步骤(3)所得所述微球硅胶C中加入氯化钾溶液，搅拌洗脱，滤出洗脱液，重复洗脱合并所得所述洗脱液，保留滤出所述洗脱液后的所述微球硅胶；所述氯化钾溶液的浓度为0.5‑2.5moC/C，所述搅拌洗脱的频率为60‑100r/min，时间为45‑65min；所述氯化钾溶液为1‑1.5moC/C，搅拌洗脱时间为70‑90min，所述氯化钾溶液的用量为步骤(1)所述酶类生化试剂滤液体积的0.5‑1倍；所述滤出洗脱液后的所述微球硅胶作为所述微球硅胶A继续进行步骤(2)制备所述微球硅胶B；(5)离心；将步骤(4)所得洗脱液先置于截留量为70KD的离心管中，离心并取下层液；将下层液置于截留量为5KD的离心管中，离心并取上层截留液，即得到所述酶类生化试剂；所述截留量为70KD离心管的转速为5000‑6000r/min时，离心时间为3‑8min；所述截留量为5KD离心管的转速为7000‑9000r/min时，离心时间为30‑50min；将所述离心液干燥后，即得到所述纯化后的酶类生化试剂。...

【技术特征摘要】
1.本发明涉及一种酶类生化试剂的纯化技术，其特征在于，包括以下步骤：(1)生物细胞预处理；a.用研钵在-5℃冷冻条件下将所述生物细胞研成粉末；b.对每10g步骤a处理后的所述生物细胞，加入0.5ml裂解液，裂解20-30分钟，将所述生物细胞裂解液收集到EP管中；以重量百分比计，所述裂解液包括0.1-0.15％的氯化钠、1.0-1.5％的EDTA、0.05-0.1％的过氧化氢和0.2-0.5％TritoAx-100；余下部分为去离子水；c.将步骤b处理好细胞悬液置于4℃下，以3000r/min转速离心5分钟；放置3-4分钟，直至所述细胞悬液变清，避开上层漂浮的脂质层，取上清液，得到酶类生化试剂预处理液；将所述酶类生化试剂搅拌均匀后，过100-150目滤网得酶类生化试剂滤液；(2)所述微球硅胶预处理；取所述微球硅胶用蒸馏水洗涤至无明显杂质并滤干，先用盐酸溶液浸泡后，再用蒸馏水冲洗得所述微球硅胶A；其中，所述微球硅胶选自聚丁二酰亚胺和3-氨基丙基硅胶制得微球中的一种；所述微球硅胶预处理，将所述微球硅胶浸泡于2-4倍所述微球硅胶体积的0.8-1.2moC/C盐酸溶液，浸泡时间为10-12h，用蒸馏水冲洗至流出液pH值为5.5-6.5，得所述微球硅胶A；再将所述微球硅胶A浸泡于2-4倍所述微球硅胶体积的0.8-1.2moC/C氢氧化钠溶液，浸泡时间为10-12h，用蒸馏水冲洗至流出液pH...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭惠芳，
申请(专利权)人：爱必信上海生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31