具有除草剂抗性的ACCase突变型基因和蛋白及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种水稻ACCase突变型蛋白，所述ACCase突变型蛋白的氨基酸序列存在以下任意一种或几种突变：其对应于野生型水稻ACCase的氨基酸序列的第1796位、第1797位、第1835位、第1875位、第2010位、第2050位、第2060位、第2070位和第2106位发生突变。本发明专利技术还公开了一种核酸或基因，其编码所述的蛋白。本发明专利技术通过转基因方法将突变型基因在除草剂敏感水稻中表达，含有该突变蛋白的植物可以抗（耐）乙酰辅酶A羧化酶类除草剂。含有本发明专利技术的水稻ACCase蛋白的水稻三叶期幼苗在施用3mL喹禾灵/L水（2倍推荐使用浓度）后，植株仍然正常生长发育和结实。

【技术实现步骤摘要】
具有除草剂抗性的ACCase突变型基因和蛋白及其应用
本专利技术属于植物蛋白和植物抗除草剂领域，涉及具有除草剂抗性的ACCase突变型基因、蛋白及其应用；具体而言，本专利技术涉及水稻的乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)突变基因及其编码的突变ACCase蛋白，该突变蛋白能赋予植物尤其水稻抗乙酰辅酶A羧化酶抑制剂类除草剂的特性。本专利技术公开了该突变蛋白的核苷酸序列和氨基酸序列，以及它们在植物抗除草剂领域中的应用。
技术介绍
农田杂草是导致农作物减产的最主要的原因之一。与传统依靠栽培措施、人工除草和机械除草等方法相比，化学除草剂的使用是人们公认的农田除草技术中最可靠且最经济的手段。自2,4-D于20世纪40年代开始使用以来，除草剂工业已有60多年的发展历史，迄今已成功开发了一大批选择性除草剂。其中乙酰辅酶A羧化酶(Acetyl-CoACarboxylase，简称ACCase)是化学除草剂的一个重要靶标。ACCase酶存在于大多数的生物体中，主要存在于细菌、酵母、真菌、植物、动物和人类中。目前已经确定在植物体内有两种同工型的ACCase，主要位于质体和细胞溶胶中，它们的功能区域在结构上有很大的差别。大多数植物质体中的ACCase有4个亚基：一个是生物素羧基载体蛋白亚基(biotincarboxylcarrier-protein，BCCP)，一个是生物素羧化酶亚基(biotincarboxylase，BC)，以及羧基转移酶(carboxyltransferase，CT)的两个亚基CTα和CTβ，二者之间以共价键相连。大多数植物细胞溶胶中的ACCase与酵母、大鼠和人的ACCase属于同一类型，它的一条多肽链包含原核型ACCase所有的4个亚基，排列顺序是BC、BCCP、CTβ、CTα，形成了3个功能域(CTβ和CTα算一个功能域)。除草剂对ACCase的抑制主要是通过抑制羧基转移酶(CT)，造成酰基脂类生物合成受到抑制，影响细胞膜渗透性，造成代谢产物渗漏，致使植物死亡，从而达到防除禾本科杂草的目的。ACCase是一种以生物素为辅基的多功能酶。它利用ATP供给的能量催化由乙酰辅酶A生成丙二酰-CoA的羧基化反应，该反应是脂肪酸全合成的第一个关键步骤，也是限速步骤，这步由ACCase催化的反应实际上是由3个亚基组成的两步反应。第一步，首先由ATP提供能量给重碳酸，产生活化的羧基(羧酸、磷酸复合物)，然后在BC作用下将羧基连接到BCCP中生物素的脲环N1上，形成羧化的生物素羧基载体蛋白，该过程中由Mg2+或者Mn2+等的参与，碳酸氢盐为羧基供体。第二步，在CT作用下，将生物素脲环N1上的羧基转移至乙酰-CoA的甲基，产生丙二酰-CoA，该过程不需要其他的辅助能量。合成的丙二酰-CoA参与脂肪酸从头合成等生物过程。对于ACCase类抑制剂的研究始于20世纪70年代，ACCase类除草剂包括芳氧苯氧丙酸酯类(Aryloxyphenoxypropanoates，APP)、芳氧苯基环己二酮类(Aryloxyphenylcy-clohexanedione，APCHD)以及三酮类环己二酮(Cyclictriketones,CTR)。由于其选择性高，能够苗后防除一年或多年生禾本科杂草，且在植物体内传导，具有高效、低毒、施用期长、对后茬作物安全等优点，此类除草剂迅速发展、品种不断增多、使用面积迅速扩大，已成为世界第三类重要除草剂。但是随着长期和大面积的使用，杂草很快对这两种除草剂产生了抗性，目前，已在26个国家发现了高达35种杂草对这两类抑制剂产生了抗性。遗憾的是，ACCase抑制剂类除草剂的作用机理尚未确定，很难提前预测ACCase蛋白其它氨基酸位点的突变是否会产生除草剂抗性，只能依赖于科研人员长期、艰苦的实践探索，并凭借一些运气才可能发现ACCase蛋白新的除草剂抗性位点。
技术实现思路
技术问题：本专利技术所要解决的技术问题是提供一种可以赋予植物抗除草剂抗性的突变型蛋白。进一步地，本专利技术所要解决的技术问题是提供一种可以赋予植物抗(耐)乙酰辅酶A羧化酶类除草剂抗性的水稻ACCase突变型蛋白。进一步地，本专利技术所要解决的技术问题是提供一种可以赋予植物抗除草剂抗性的突变型基因。进一步地，本专利技术所要解决的技术问题是提供一种可以赋予植物抗(耐)乙酰辅酶A羧化酶类除草剂抗性的水稻ACCase突变型基因。为此，本专利技术提供了一种编码水稻ACCase突变型蛋白的核酸或基因。在一种实施方式中，本专利技术提供了一种水稻ACCase突变型蛋白，所述ACCase突变型蛋白的氨基酸序列存在以下任意一种或多种突变：其对应于水稻ACCase的氨基酸序列的第1796位、第1797位、第1835位、第1875位、第2010位、第2050位、第2060位、第2070位、第2106位发生突变。作为优选，本专利技术的水稻ACCase的氨基酸序列第1796位氨基酸由丙氨酸突变为甘氨酸、第1797位氨基酸由丙氨酸突变为脯氨酸、第1835位氨基酸由谷氨酰胺变为脯氨酸、第1875位氨基酸由缬氨酸变为苯丙氨酸、第2010位氨基酸由色氨酸变为甘氨酸、第2010位氨基酸由色氨酸变为半胱氨酸、第2050位氨基酸由谷氨酸变为甘氨酸、第2060位氨基酸由缬氨酸变为亮氨酸、第2070位氨基酸由丙氨酸变为缬氨酸、第2106位氨基酸由赖氨酸变为谷氨酸。优选地，本专利技术的水稻ACCase的氨基酸序列第1796位氨基酸为除了丙氨酸之外的其它氨基酸、第1797位氨基酸为除了丙氨酸之外的其它氨基酸、第1835位氨基酸为除了谷氨酰胺之外的其它氨基酸、第1875位氨基酸为除了缬氨酸之外的氨基酸、第2010位氨基酸为除了色氨酸之外的其它氨基酸、第2010位氨基酸为除了色氨酸之外的其它氨基酸、第2050位氨基酸为除了谷氨酸之外的其它氨基酸、第2060位氨基酸为除了缬氨酸之外的其它氨基酸、第2070位氨基酸为除了丙氨酸之外的其它氨基酸、第2106位氨基酸为除了赖氨酸之外的其它氨基酸。优选地，本专利技术的ACCase突变型蛋白发生突变的氨基酸包括但不仅限于以下几种突变，在以下位点突变成其他氨基酸的情况也在本专利技术的保护范围之内，例如：第1796位氨基酸由丙氨酸突变为苯丙氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、脯氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、色氨酸、赖氨酸、组氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、缬氨酸、谷氨酸、天冬氨酸；第1797位氨基酸由丙氨酸突变为苯丙氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、色氨酸、赖氨酸、组氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、缬氨酸、谷氨酸、天冬氨酸；第1835位氨基酸由谷氨酰胺变为苯丙氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、色氨酸、赖氨酸、组氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、天冬氨酸；第1875位氨基酸由缬氨酸突变为丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、脯氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、色氨酸、赖氨酸、组氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸；第2010位氨基酸由色氨酸变为苯丙氨酸、丝氨酸、酪氨酸、脯氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、组氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种水稻ACCase突变型蛋白，所述ACCase突变型蛋白的氨基酸序列存在以下任意一种或多种突变：其对应于野生型水稻ACCase的氨基酸序列的第1796位、第1797位、第1835位、第1875位、第2010位、第2050位、第2060位、第2070位和第2106位发生突变。

【技术特征摘要】
1.一种水稻ACCase突变型蛋白，所述ACCase突变型蛋白的氨基酸序列存在以下任意一种或多种突变：其对应于野生型水稻ACCase的氨基酸序列的第1796位、第1797位、第1835位、第1875位、第2010位、第2050位、第2060位、第2070位和第2106位发生突变。2.一种水稻ACCase突变型蛋白，包括：（a）其氨基酸序列选自由SEQIDNO.2、SEQIDNO.4、SEQIDNO.6、SEQIDNO.8、SEQIDNO.10、SEQIDNO.12、SEQIDNO.14、SEQIDNO.16、SEQIDNO.18和SEQIDNO.20组成的组中；或（b）在（a）中的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或多个氨基酸，且具有乙酰辅酶A羧化酶活性的由（a）衍生的蛋白质。3.一种核酸或基因，其编码根据权利要求1~2任一项所述的蛋白。4.根据权利要求3所述的核酸或基因，包括：（i）其编码权利要求1~2任一项所述的蛋白；或（ii）在严格条件下与（a）限定的核苷酸序列杂交且编码具有乙酰辅酶A羧化酶活性的蛋白质的核苷酸序列；或（iii）其核苷酸序列选自由SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17和SEQIDNO:19组成的组中。5.一种表达盒、重组载体或细胞，其含有根据权利要求3或4所述的核酸或基因。6.根据权利要求1或2所述的水稻ACCase突变型蛋白、根据权利要求3或4...

【专利技术属性】
技术研发人员：张保龙，王金彦，凌溪铁，郭冬姝，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：江苏,32