一种基于分子印迹分离纯化埃博霉素D的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于分子印迹分离纯化埃博霉素D的方法，将EpoD分子印迹聚合物用少量纯甲醇浸泡，装入分离柱内，依次使用甲醇‑醋酸、甲醇、甲醇‑去离子水淋洗柱子，抽真空压实柱子；取EpoD粗品溶于20‑80%甲醇水溶液，加入到装好的柱子内；静置20‑50min后，淋洗柱子，去除干扰物，进一步减少杂质干扰；使用10‑90%的甲醇PBS溶液作为洗脱液洗脱柱子，使得EpoD完全溶解于洗脱液内，收集洗脱液并旋转蒸干，纯甲醇复溶，得到纯化的EpoD甲醇溶液。相对于已有的分离纯化方法，其操作简单、方便，成本低，同时在埃博霉素D吸附过程中为特异性吸附，能达到更好的分离效果。为进一步的埃博霉素D分离纯化提供可能性。

A Method for Separation and Purification of Ebomycin D Based on Molecular Imprinting

The invention discloses a method for separating and purifying EpoD based on molecular imprinting. EpoD molecularly imprinted polymer is immersed in a small amount of pure methanol and then packed into the separation column. The column is washed with methanol, acetic acid, methanol, methanol and deionized water in turn, and vacuum compacted. The crude EpoD product is dissolved in 20 80% methanol aqueous solution and added into the packed column after 20 50 minutes'static storage. Eluting column, removing interfering substances, further reducing impurity interference; using 10 90% methanol PBS solution as eluent eluent column, making EpoD completely dissolved in eluent, collecting eluent and rotating evaporation, pure methanol re-dissolved, purified EpoD methanol solution was obtained. Compared with the existing separation and purification methods, the method is simple, convenient and low cost. At the same time, it is a specific adsorption in the process of ebomycin D adsorption, which can achieve better separation effect. It is possible to further isolate and purify Ebomycin D.

【技术实现步骤摘要】
一种基于分子印迹分离纯化埃博霉素D的方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种基于分子印迹分离纯化埃博霉素D的方法。
技术介绍
埃博霉素(epothilone)是一类大环内酯类化合物，由德国国家生物技术中心(GBF)的G.Höfle等人于1993年首次报道。从粘细菌亚目的纤维堆囊菌菌株发酵液中可以分离埃博霉素，其主要组分为EpothiloneA和B。埃博霉素Ａ、Ｂ和Ｄ对癌细胞的生物活性与紫杉醇相当，甚至更强，尤其是埃博霉素Ｂ，其活性比紫杉醇强10-100倍．在Ｃ12位上的有甲基取代，以及Ｃ12-Ｃ13双键换成环氧基团后，埃博霉素的活性将极大提高。埃博霉素具有比紫杉醇优越的抗肿瘤特性：①埃博霉素比紫杉醇水溶性好，结构简单，有利于化学合成埃博霉素及结构衍生化。②埃博霉素没有紫杉醇细胞内毒素活性。③与紫杉醇不同，埃博霉素在P糖蛋白表达型的多药耐药性细胞中也维持很大的细胞毒性。埃博霉素具有比紫杉醇类更优越的抗肿瘤特性，在替代紫杉醇类药物的研究中已表现出极大的潜力，并且在抗肿瘤领域已经展现出其巨大的价值。但是在其生产过程中的成本较高，已经成为人们急需解决的问题。除了其生产菌产量低而且生长周期长、易感染等因素，在埃博霉素的分离提纯方面也存在着很大的因素。因为纤维堆囊菌的表达产物成分复杂多样，极大提升的埃博霉素分离纯化的难度。目前有关于埃博霉素分离纯化的方法主要有：葡聚糖凝胶结合PHPLC分离纯化路线，其纯度可达90%以上，但是回收率较低，仅有75%左右，且填料成本高，操作相对复杂；C18常压反向柱层析分离纯化路线，其回收率可达80%，纯度可达85%，其填料成本较高，且回收率较低；离子交换柱层析分离纯化路线，其回收率可达90%，但是纯度60%远远达不到实际应用的要求。因此为了能够达到实际生产和应用的需求，在埃博霉素分离纯化的研究中还有许多问题需要克服。
技术实现思路
本专利技术提供一种埃博霉素D分离纯化的方法，相对于上述分离纯化方法，其操作简单、方便，成本低，同时在埃博霉素D吸附过程中为特异性吸附，能达到更好的分离效果。为了达到上述目的，本专利技术采用的技术手段如下：一种基于分子印迹分离纯化埃博霉素D的方法，包括如下步骤：1）埃博霉素D分子印迹聚合物的制备：取0.1mmol模板分子，0.1-1.0mmol功能单体，0.5-3.0mmol交联剂混合后，加入50mL致孔剂静止1-2h，加入30mg引发剂，超声振荡20min后，立即通入氮气10-20min；然后在40-55℃下聚合反应10-24h，再在55-65℃下聚合反应10-24h；聚合反应完成后将反应产物破碎、研磨、过筛后得到粒径为40-60μm的聚合反应物，再用200mL乙酸/甲醇混合液连续冲洗数次后，纯甲醇洗涤数次，真空干燥得埃博霉素分子印迹聚合物；2）分子印迹聚合物分离柱装填：将EpoD分子印迹聚合物用少量纯甲醇浸泡，装入20ml分离柱内（底部加滤膜），依次使用甲醇-醋酸、甲醇、甲醇-去离子水淋洗柱子，抽真空压实柱子；3）上样：取2mg的EpoD粗品溶于10-20ml的20-80%甲醇水溶液，加入到装好的柱子内；4）吸附、淋洗：静置20-50min后，使用去离子水、甲醇、乙腈、乙酸或其混合物淋洗柱子，去除干扰物，进一步减少杂质干扰；5）洗脱：使用10-90%的甲醇PBS溶液作为洗脱液洗脱柱子，使得EpoD完全溶解于洗脱液内，收集洗脱液并旋转蒸干，纯甲醇复溶，得到纯化的EpoD甲醇溶液。步骤1）中所述模板分子为埃博霉素A~D中的一种或者多种混合。优选为埃博霉素D与埃博霉素A以1:1的比例混合的混合物。步骤1）中所述功能单体为丙烯酸、甲基丙烯酸、丙烯酰胺、烯丙胺或2-丙烯酰胺基-2-甲基丙磺酸中的至少一种。步骤1）中交联剂为2-甲基丙烯酸乙二醇酯、4-咪唑丙烯酸乙酯、N,N-亚甲基双丙烯酰胺或4-咪唑丙烯酸中至少一种。步骤1）中引发剂为偶氮二异丁腈或过氧化二苯甲酰；致孔剂为乙酸乙酯、丙酮或二者混合物。步骤2）中甲醇-醋酸溶液中甲醇与醋酸的体积比为10:1；甲醇-去离子水溶液中甲醇与去离子水的体积比为1:1。步骤3）中甲醇水溶液浓度为60%。步骤5）中洗脱液为80%的甲醇PBS溶液（100mL洗脱液中包含80mL甲醇,20mLPBS）。进一步优选地，步骤1）中模板分子与交联剂比例为1:20，模板分子与功能单体的比例为1：6。实验所用的埃博霉素D高产菌来源于购买的菌株（上海研生）。通过EpoD分子印迹聚合物的特异性吸附从而使发酵液中的EpoD达到良好的分离效果。本专利技术中待分离的埃博霉素D粗品可以为任意菌株发酵所得的包含埃博霉素D的发酵液，或者是任意化学方法制备的包含埃博霉素D的粗溶液等。本专利技术以发酵制备得到的发酵液为例，说明埃博霉素D的分离方法：将纤维堆囊菌菌株接种于放有已灭菌滤纸片的CNST平板上，培养4d，转接到M26培养基上继续培养3d后制成种子液，并将其按照10%（V/V）接种到含有5%XAD-16树脂的发酵培养基内，28℃培养4~6d后过滤收集树脂；将收集到的树脂置于PH6.0的75%的甲醇溶液内，并于摇床上200r/min解析2h。收集解析液旋转蒸发至少量，真空干燥至干品，用纯甲醇复溶，8000r/min离心10min，过滤，HPLC检测埃博霉素D含量并将粗品4℃冷藏保存备用。本专利技术中分子印迹聚合物分离柱装填，具体为：称取400.0mgEpoD分子印迹聚合物，少量纯甲醇浸泡，装入20ml注射器内（底部加滤膜），依次使用40ml甲醇/醋酸（10:1），40ml甲醇、40ml甲醇/去离子水（1:1）淋洗柱子，抽真空压实柱子。本专利技术中埃博霉素D含量测定：采用HPLC定量分析，检测条件：色谱柱，C18，10μm，4.6x250mm；UV检测仪；流动相，甲醇（色谱纯）：去离子水=3:1；流速为1.0mL/min；检测波长为249nm；进样量为20μL；柱温为25℃。致孔剂为乙酸乙酯、丙酮或二者混合物（V:V=1:1、1:3、2:3、3:2、3:1）。本专利技术所涉及到的培养基配方为：CNST培养基：KN030.5g/L，Na2HP040.25g/L，MgSO41.0g/L，FeCl30.01g/L，TE溶液1.0ml/L，琼脂16g/L，pH7.2；其中TE溶液的组成为MnCl2·4H2O100mg/L，CoCl220mg/L，CuS0410mg/L，Na2Mo04·2H2010mg/L，ZnCl220mg/L，LiCl5mg/L，SnCl2·2H205mg/L，H3BO310mg/L，KBr20mg/L，KI20mg/L；M26培养基：七水硫酸镁0.05g/L，一水硫酸锰0.05g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二钾2g/L，ＮａＣL５g/L，酵母粉２g/L，葡萄糖15g/L，大豆蛋白胨10g/L，土豆淀粉10g/L，琼脂15g/L，其余为水，pH调至7.2，115℃灭菌30min；种子培养基：七水硫酸镁0.05g/L，一水硫酸锰0.05g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二钾2g/L，ＮａＣL5g/L，酵母粉2g/L，葡萄糖15g/L，大豆蛋白胨10g/L，土豆淀粉10g/L，其余为水，pH调至7.2，115℃灭菌30min；发酵培养基：七水硫酸镁0.05g/L，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于分子印迹分离纯化埃博霉素D的方法，其特征在于，包括如下步骤：1）埃博霉素D分子印迹聚合物的制备：取0.1mmol模板分子，0.1‑1.0mmol功能单体，0.5‑3.0mmol交联剂混合后，加入50mL致孔剂静止1‑2h，加入30mg引发剂，超声振荡20min后，立即通入氮气10‑20min ；然后在40‑55℃下聚合反应10‑24 h，再在55‑65℃下聚合反应10‑24h ；聚合反应完成后将反应产物破碎、研磨、过筛后得到粒径为40‑60μm的聚合反应物，再用200mL乙酸/甲醇混合液连续冲洗数次后，纯甲醇洗涤数次，真空干燥得埃博霉素分子印迹聚合物；2）分子印迹聚合物分离柱装填：将EpoD分子印迹聚合物用少量纯甲醇浸泡，装入底部加滤膜的分离柱内，依次使用甲醇‑醋酸、甲醇、甲醇‑去离子水淋洗柱子，抽真空压实柱子；3）上样：将EpoD粗品溶于 20‑80%甲醇水溶液，加入到装好的柱子内；4）吸附、淋洗：静置20‑50min后，使用去离子水、甲醇、乙腈、乙酸或其混合物淋洗柱子，去除干扰物，进一步减少杂质干扰；5）洗脱：使用10‑90%的甲醇PBS溶液（甲醇和PBS按一定体积混合）作为洗脱液洗脱柱子，使得EpoD完全溶解于洗脱液内，收集洗脱液并旋转蒸干，纯甲醇复溶，得到纯化的EpoD甲醇溶液。...

【技术特征摘要】
1.一种基于分子印迹分离纯化埃博霉素D的方法，其特征在于，包括如下步骤：1）埃博霉素D分子印迹聚合物的制备：取0.1mmol模板分子，0.1-1.0mmol功能单体，0.5-3.0mmol交联剂混合后，加入50mL致孔剂静止1-2h，加入30mg引发剂，超声振荡20min后，立即通入氮气10-20min；然后在40-55℃下聚合反应10-24h，再在55-65℃下聚合反应10-24h；聚合反应完成后将反应产物破碎、研磨、过筛后得到粒径为40-60μm的聚合反应物，再用200mL乙酸/甲醇混合液连续冲洗数次后，纯甲醇洗涤数次，真空干燥得埃博霉素分子印迹聚合物；2）分子印迹聚合物分离柱装填：将EpoD分子印迹聚合物用少量纯甲醇浸泡，装入底部加滤膜的分离柱内，依次使用甲醇-醋酸、甲醇、甲醇-去离子水淋洗柱子，抽真空压实柱子；3）上样：将EpoD粗品溶于20-80%甲醇水溶液，加入到装好的柱子内；4）吸附、淋洗：静置20-50min后，使用去离子水、甲醇、乙腈、乙酸或其混合物淋洗柱子，去除干扰物，进一步减少杂质干扰；5）洗脱：使用10-90%的甲醇PBS溶液（甲醇和PBS按一定体积混合）作为洗脱液洗脱柱子，使得EpoD完全溶解于洗脱液内，收集洗脱液并旋转蒸干，纯甲醇复溶，得到纯化的EpoD甲醇溶液。2.根据权利要求1所述的一种基于分子印迹分离纯化埃博霉素D的方法，其特征在于，步骤1）中所述模板分子为埃博霉素A~D中的一种或者多种混合。3.根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：虞龙，张娣，饶远，张宁，李市场，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32