本发明专利技术属于植物基因工程领域，具体涉及控制甘蓝型油菜角果长和粒重性状的基因qSLWA9的克隆与育种应用。通过图位克隆得到一种控制甘蓝型油菜角果长性状的主效QTL SLWA9基因，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其编码区即CDS序列如SEQ ID NO:2所示，该基因编码的蛋白质序列如SEQ ID NO:3所示。该位点位于甘蓝型油菜A9染色体上，同时控制角果长和千粒重两个产量性状。试验表明，qSLWA9的表达水平正调控了油菜角果长和粒重性状。本发明专利技术克隆的qSLWA9基因可应用于甘蓝型油菜的遗传改良。本发明专利技术还开发出的相应的分子标记引物，这些标记引物可用于甘蓝型油菜的分子标记辅助育种。
Cloning and Breeding Application of a Gene qSLWA9 Controlling Characters of Cape Length and Grain Weight in Brassica napus
The invention belongs to the field of plant genetic engineering, and specifically relates to the cloning and Breeding Application of the gene qSLWA9 for controlling the characters of horn length and grain weight of Brassica napus. A major QTL SLWA9 gene was cloned by map-based cloning. The nucleotide sequence of SLWA9 gene was shown as SEQ ID NO:1, the coding region of CDS gene was shown as SEQ ID NO:2, and the protein sequence of SLWA9 gene was shown as SEQ ID NO:3. This locus is located on chromosome A9 of Brassica napus and controls two yield traits of pod length and 1000-grain weight. The results showed that the expression level of qSLWA9 positively regulated the characters of pod length and grain weight in rapeseed. The qSLWA9 gene cloned by the invention can be applied to genetic improvement of Brassica napus. The invention also develops corresponding molecular marker primers, which can be used in molecular marker assisted breeding of Brassica napus.
【技术实现步骤摘要】
控制甘蓝型油菜角果长和粒重性状的基因qSLWA9的克隆与育种应用
本专利技术属于植物基因工程领域，具体涉及一种控制甘蓝型油菜角果长和粒重性状的基因qSLWA9的克隆与育种应用。本专利技术具体涉及控制甘蓝型油菜角果长和粒重性状的基因qSLWA9的分离克隆、功能验证及应用。
技术介绍
甘蓝型油菜(BrassicanapusL.)是一种被广泛种植的油料作物，其产量的提高是油菜育种中的重要目标。油菜的籽粒产量主要由单位面积有效角果数、每角果粒数和粒重三大因子构成，每个构成因子都在产量的提高中都发挥着重要作用(Chenetal.,2007)。这些产量相关性状都是典型的数量性状，由数量性状基因位点(QTL)控制。甘蓝型油菜是由二倍体的祖先种白菜(B.rapa)和甘蓝(B.oleracea)通过自然杂交并经历全基因组加倍而形成的异源四倍体物种(Chalhoubetal.,2014)，基因组的复杂性增加了对产量相关性状QTL基因克隆的难度。目前，甘蓝型油菜产量相关性状的研究仍集中在QTL的定位工作上，成功通过图位克隆技术克隆到基因的报道还很少。因此，克隆产量相关性状的QTL基因，揭示其分子机理，对提高油菜产量具有重要意义。角果作为包含种子的重要器官，不仅保护种子免受外界病虫等的危害，同时也为种子提供其发育所需的光合产物和营养物质(Bennettetal.,2011)。此外，研究表明，角果皮的光合作用也与籽粒的油份含量密切相关(Huaetal.,2012)。角果的长度与每角果籽粒数和粒重呈正相关。长角果能够提供更大的光合面积和营养物质存储空间，为种子合成更多的油份和蛋白质等物质提供基础，增加了籽粒大小和重量。前人研究表明，在一定范围内，角果长度的增加可以提高每角果粒数和粒重(ChayandThurling1989；刘定富等，1994；冷锁虎等，2005)。“川农长角”是四川省农业科学院在上世纪六十年代选育的高产油菜品种(覃民权等，1962)，中双11号(ZS11)是中国农业科学院油料作物研究所选育的一个高产品种(余波，2008)。这两个品种的共同特点是角果长，千粒重高(Lietal.,2014)。育种实践表明，适当增加甘蓝型油菜的角果的长度，增加千粒重是提高产量的有效途径。因此，定位并克隆控制角果长和粒重的主效QTL基因，可以为油菜高产育种提供分子标记和目标基因，有针对性地开展分子标记辅助高产育种。
技术实现思路
本专利技术的目的通过图位克隆提供一种控制甘蓝型油菜角果长和粒重的QTL基因qSLWA9，利用该基因进行甘蓝型油菜的高产育种的改良。申请人将本专利技术克隆的调控甘蓝型油菜角果长和粒重的QTL主效基因命名为SiliqueLengthandSeedWeightA9基因(简称qSLWA9基因)，该基因的核苷酸序列如序列表SEQIDNO:1所示，序列全长为1756bp，其编码区即CDS序列如SEQIDNO：2所示，该基因(即SEQIDNO:2)编码的蛋白质序列如SEQIDNO:3所示。该基因编码一个细胞色素单加氧酶家族成员CYP78A9。通过遗传互补实验、表达实验等证实了qSLWA9基因表达量的升高可使角果长度和粒重增加。本专利技术的技术方案如下：利用一个由甘蓝型油菜自交系S1(一个公知公用的甘蓝型油菜材料)和S2(一个公知公用的甘蓝型油菜材料)衍生出的共189个重组自交系(命名为L001，L002，……，L186)(Yangetal.,2012)进行QTL定位时，在A9染色体上鉴定出一个同时控制角果长和千粒重的主效QTL，来自亲本S1的等位基因型能够同时增加角果长和千粒重(Yangetal.,2012)。L133是该QTL为杂合基因型的残余杂合系，其自交的后代单株中，L133-2(NIL(S1))株表现是长角果、大粒，QTL位点为S1纯合基因型，L133-3(NIL(S1))株表现是短角果、小粒，QTL位点为S2纯合基因型，将两个单株杂交的F1代单株套袋自交，产生的F2分离群体用于精细定位。通过一个包含9737株大的分离群体的基因型和表型的鉴定，最终将QTL区间定位在标记SL5和SL15之间。通过对该区段内基因表达水平，确定了两个候选基因。通过对候选基因在亲本中(S1与S2)的比较测序，发现这两个候选基因中的一个基因的氨基酸序列在亲本间无差异，S1与S2相比较，S1该基因的起始密码子(ATG)上游3.9-kb区段内存在一个核苷酸的改变和2个氨基酸的插入，在3.9-kb处插入了一段3.7-kb的DNA片段；另一个候选基因在S1基因组中缺失。遗传转化实验表明，在S1基因组中缺失的基因不是目的基因，而另一个候选基因(qSLWA9)的起始密码子上游3.9-kb处插入的3.7-Kb而不是3.9-Kb序列上核苷酸的变化能互补短角果受体的表型，使得角果长和千粒重增加。利用qRT-PCR和GUS组织化学染色实验分析了qSLWA9基因在甘蓝型油菜中的各组织表达情况。本专利技术获得一种控制甘蓝型油菜角果长、粒重性状的基因qSLWA9，其核苷酸序列如序列表SEQIDNO:1所示。该基因编码的蛋白质序列如SEQIDNO:3所示。本专利技术克隆的基因qSLWA9可在甘蓝型油菜改良和高产育种中的应用。申请人优选了一种适用于油菜改良的分子标记，该分子标记的序列如下所示(即序列表SEQIDNO:4,SEQIDNO:5所对应的序列)：正向引物：CACACACTCTCTCCCTCTCCTT，反向引物：ATGAACACAACACACCGGATAA。本专利技术的分子标记可在甘蓝型油菜辅助选择中的应用。本专利技术的优点在于：在甘蓝型油菜中克隆了一个对角果长、粒重产量相关性状具有较大正调控效应的主效QTL基因qSLWA9，为甘蓝型油菜的高产育种提供了新的基因资源。更详细的技术方案参见《具体实施方式》。附图说明序列表SEQIDNO:1是本专利技术克隆的主效基因qSLWA9的核苷酸序列。序列长度为1756bp。序列表SEQIDNO:2是本专利技术克隆的主效基因qSLWA9的CDS序列。序列长度为1599bp。序列表SEQIDNO:3是本专利技术克隆的主效基因qSLWA9编码的蛋白质序列。编码532个蛋白质。序列表SEQIDNO:4是本专利技术优选的分子标记(正向引物，即标记名称BrGMS4935)的序列。序列表SEQIDNO:5是本专利技术优选的分子标记(反向引物，即标记名称BrGMS4935)的序列。序列表SEQIDNO:6是本专利技术优选的分子标记(正向引物，即标记名称BrGMS4931)的序列。序列表SEQIDNO:7是本专利技术优选的分子标记(反向引物，即标记名称BrGMS4931)的序列。序列表SEQIDNO:8是本专利技术优选的分子标记(正向引物，即标记名称BrGMS4937)的序列。序列表SEQIDNO:9是本专利技术优选的分子标记(反向引物，即标记名称BrGMS4937)的序列。序列表SEQIDNO:10是本专利技术优选的分子标记(正向引物，即标记名称BrGMS4940)的序列。序列表SEQIDNO：11是本专利技术优选的分子标记(反向引物，即标记名称BrGMS4940)的序列。序列表SEQIDNO:12是本专利技术优选的分子标记(正向引物，即标记名称BrGMS4942)的序列。序列表SEQIDNO：13是本专利技术优选的分本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种控制甘蓝型油菜角果长、粒重性状的基因qSLWA9，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示。
【技术特征摘要】
1.一种控制甘蓝型油菜角果长、粒重性状的基因qSLWA9，其核苷酸序列如序列表SEQIDNO:1所示。2.如权利要求1所述的基因，该基因编码的蛋白质序列如SEQIDNO:2所示。3.权利要求1或2所述的基因qSLWA9在甘蓝型油菜改良和高产育种中的应用...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘克德，王晶，石柳柳，宋居容，王博，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42
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