本发明专利技术涉及一种调控植物阿魏酸合成代谢的BdREF2基因及其应用，属于基因工程领域；本发明专利技术从二穗短柄草cDNA文库中分离出一个松柏醛脱氢酶基因，命名为BdREF2；采用CRISPER/Cas9基因编辑系统将二穗短柄草基因组中的BdREF2基因敲除，发现BdREF2的突变可引起植株细胞壁中阿魏酸酯化物含量降低，而生物质的降解效率明显提高，表明BdREF2基因可应用于禾本科植物生物质可降解性的遗传改良；本发明专利技术首次直接证明了参与调控阿魏酸生物合成的REF同源基因可以应用于提高禾本科植物生物质降解转化效率的遗传改良中，对于禾本科能源草、牧草以及农作物秸秆等生物质的资源化高效利用具有重要价值。
【技术实现步骤摘要】
一种调控植物阿魏酸合成代谢的BdREF2基因及其应用
本专利技术涉及一种调控植物阿魏酸合成代谢的BdREF2基因及其应用，属于基因工程领域。
技术介绍
木质纤维素（lignocellulose）是生物质资源的主要存在形式，具有储量丰富、可持续再生、环境友好等特点，其高效转化利用在解决能源和环境问题方面有巨大潜力。其中，从原料的自然生物属性、生态经济属性和易转化利用的能源化属性要求来评价，芒草、杂交狼尾草、柳枝稷等禾本科木质纤维素类草本植物综合优势明显，是理想的能源植物，其生物质可用于纤维素乙醇或沼气发酵。同时，它们也是重要的牧草资源，也可以经过生物炼制生产各种化学品或其它生物基材料，替代石油基材料。上述几种应用在本质上均是通过微生物或酶的作用将木质纤维素中的纤维素、半纤维素等大分子降解转化为可利用的单糖或寡糖等成分。然而，陆生植物在长期进化过程中形成了由纤维素、半纤维素和木质素为主要成分的结构致密而复杂的细胞壁，其中木质素能够抵抗自然界多数微生物的有效降解，它与半纤维素共价交联在一起并紧密包裹着纤维素，使木质纤维素降解酶（包括纤维素、半纤维素和木质素降解酶系）难以穿透由两者所形成的分子结构屏障，极大降低了对纤维素等大分子的水解效率，造成生物质降解转化的技术难度大、成本高，通常需要借助高温、高压、蒸汽或加酸、碱等步骤对木质纤维素进行预处理。但预处理目前仍是纤维素乙醇等生产工艺中成本最高的环节之一，设备要求高，耗能高，对环境不友好，严重制约了生物质产业发展，是公认的国际性难题。综上所述，木质纤维素类草本植物的生物质不管是作为能源、饲草或是生物炼制利用，都亟待解决“如何打破植物细胞壁坚固的抗降解屏障，提高木质纤维素生物转化效率”这一重大挑战。禾本科等单子叶植物细胞壁的阿魏酸化是不同于双子叶植物细胞壁的一个显著特征。阿魏酸（Ferulicacid,FA）即4-羟基-3-甲氧基肉桂酸，在禾本科植物细胞壁中，FA分子主要以酯键共价连接在阿拉伯糖葡糖醛酸木聚糖（GAX）或阿拉伯木聚糖（AX）的α-L-阿拉伯呋喃糖（Araf）残基C-5上，而FA分子之间又可以通过自由基耦合反应生成脱氢阿魏酸酯二聚体、三聚体等低聚体，从而将不同木聚糖分子交联起来，形成木聚糖阿魏酸酯，木聚糖阿魏酸酯可以进一步与木质素单体如松柏醇（Coniferylalcohol）或芥子醇（Sinapylalcohol）通过生成醚键共价交联成二聚体，这些二聚体继续与新的木质素单体发生偶合反应，最后形成木质素-阿魏酸-阿拉伯木聚糖复合物，因此，FA是半纤维素分子之间以及半纤维素与木质素分子之间共价交联的“桥梁”，在禾本科植物细胞壁复杂异质的高分子网络结构形成及其木质化过程中起关键作用。有研究表明，黑麦草（LoliumperenneL.）和水虉草（PhalarisaquaticL.）等牧草生物质的降解率与其FA含量呈负相关性；还有研究证明，木质素对细胞壁发酵降解的抑制效应至少50%是由阿魏酸-木质素的共价交联所导致。因此，通过调控细胞壁内FA酸的生物合成来降低FA和木质素之间的交联程度有可能是改善木质纤维素可降解性的有效途径，对于禾本科能源草、牧草以及农作物秸秆等生物质的资源化高效利用具有重要价值。植物细胞壁中的阿魏酸是由苯丙氨酸通过苯丙烷代谢途径而合成的，但阿魏酸生物合成的具体通路及其调控基因还未完全明确。在双子叶模式植物拟南芥中曾克隆获得一个REF1基因（ReducedEpidermalFluorescence1），REF1编码蛋白是一种乙醛脱氢酶，具有松柏醛脱氢酶/芥子醛脱氢酶活性，可以在苯丙烷代谢途径中将松柏醛和芥子醛分别氧化生成阿魏酸和芥子酸。并且，在甲磺酸乙酯（Ethylmethanesulfonate,EMS）化学诱变产生的拟南芥REF1突变体细胞壁中，阿魏酸酯化物含量比野生型对照降低约50%，因此REF1是一个参与调控阿魏酸生物合成的重要基因，但是REF1基因表达的变化是否可以影响植株生物质的可降解性则迄今尚未有研究报道。二穗短柄草（Brachypodiumdistachyon）是一年生的禾本科短柄草属植物，与小麦、水稻等粮食作物亲缘近，生育期短，基因组小，被作为一种新型的禾本科模式植物加以广泛研究。本专利技术中选择二穗短柄草（Brachypodiumdistachyon）为对象进行研究。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种从禾本科模式植物二穗短柄草中克隆获得的调控植物细胞壁阿魏酸生物合成代谢的松柏醛脱氢酶基因BdREF2，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，其氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。本专利技术还提供一种重组载体pET22b-BdREF2，所述载体包含二穗短柄草松柏醛脱氢酶基因BdREF2，所述基因BdREF2插入表达载体pET22b(+)的NdeI和NotI酶切位点之间。本专利技术还提供一种含有松柏醛脱氢酶基因BdREF2的大肠杆菌BL21（DE3）。本专利技术还公开了所述松柏醛脱氢酶基因BdREF2在木质纤维素降解中的应用。进一步的，所述应用为调控阿魏酸合成代谢，具体的是所述基因BdREF2能水解松柏醛氧化生成阿魏酸单体。进一步的，所述松柏醛脱氢酶基因BdREF2可应用于提高禾本科植物生物质降解转化效率。更进一步的，所述松柏醛脱氢酶基因BdREF2在培育生物质易降解转化的植物新品种中的应用，具体的，所述应用为敲除二穗短柄草中的BdREF2基因。与现有技术相比较，本专利技术产生的有益效果如下：本专利技术从实验室构建的二穗短柄草cDNA文库中分离出一个拟南芥REF1类似基因片段，但试验证明，该基因的编码蛋白仅有松柏醛脱氢酶活性，无芥子醛脱氢酶活性，因此它与拟南芥REF1并非直系同源基因（Orthologousgene），命名为BdREF2。进一步采用CRISPER/Cas9基因编辑系统将二穗短柄草基因组中的BdREF2基因敲除，发现BdREF2的突变可引起植株细胞壁中阿魏酸酯化物含量降低，而生物质的降解效率明显提高，表明BdREF2基因可应用于禾本科植物生物质可降解性的遗传改良。本专利技术首次直接证明了参与调控阿魏酸生物合成的REF同源基因可以应用于提高禾本科植物生物质降解转化效率的遗传改良中，对于禾本科能源草、牧草以及农作物秸秆等生物质的资源化高效利用具有重要价值。附图说明图1为BdREF2蛋白序列中保守结构域的模式图。图2为BdREF2蛋白与其它6种近缘植物中同源蛋白的多序列比对图。图3为BdREF2基因在二穗短柄草中的表达模式图。图4为BdREF2重组蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳图：M为蛋白分子量，1和2分别在0和1mmol/LIPTG浓度下30℃诱导表达4h后的蛋白产物，3、4和5分别为用浓度为50mmol/L、150mmol/L、250mmol/L咪唑缓冲液洗脱纯化后的重组蛋白。图5为BdREF2重组蛋白氧化松柏醛生成阿魏酸的HPLC分析图：FA为阿魏酸单体，conald为松柏醛。图6为BdREF2基因编辑位点附近发生的InDel单碱基突变。图7为二穗短柄草BdREF2基因编辑突变体细胞壁中阿魏酸酯化物的含量变化，图中，WT为野生型二穗短柄草，M01-M05是5个基因编辑植株。图8为二穗短柄草BdREF2基因编辑突变体生物质降本文档来自技高网...
【技术保护点】
1. 一种调控植物阿魏酸合成代谢的松柏醛脱氢酶基因BdREF2，所述基因BdREF2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
【技术特征摘要】
1.一种调控植物阿魏酸合成代谢的松柏醛脱氢酶基因BdREF2，所述基因BdREF2的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。2.一种重组载体pET22b-BdREF2，其特征在于，所述载体包含松柏醛脱氢酶基因BdREF2，所述基因BdREF2插入表达载体pET22b(+)的NdeI和NotI酶切位点之间。3.一种含有权利要求1所述的松柏醛脱氢酶基因BdREF2的重组菌。4.权利要求1所述的松柏醛脱氢酶基因BdREF2在木质纤维素降解中的应用。5.根据权利要求4所述的...
【专利技术属性】
技术研发人员：蒋建雄，齐旭莉，孙建中，
申请(专利权)人：江苏大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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