一种筛选大菱鲆饲料保护剂的方法技术

本发明专利技术的提供一种筛选大菱鲆饲料保护剂的方法，可以有效的筛选对大菱鲆肠道健康有效的保护剂，以及其添加量。本发明专利技术可以用于鱼类肠炎保护剂的筛选，通过对组织、细胞、分子三个不同水平的考察，结合鱼类的肠道生理特点、肠道组织特点，保证了评价方法的系统性、全面性，所获得的结果能够为提高鱼类肠道健康、减少疾病发生的利用提供依据。

A Method for Screening Feed Protective Agents for Turbot (Scophthalmus maximus)

The invention provides a method for screening dietary protective agents for turbot, which can effectively screen effective protective agents for intestinal health of turbot and their dosage. The method can be used for screening protective agents for fish enteritis. By investigating three different levels of tissue, cell and molecule, combining with the physiological characteristics of intestinal tract and intestinal tissue characteristics of fish, the systematicness and comprehensiveness of the evaluation method are ensured, and the results obtained can provide a basis for improving the intestinal health of fish and reducing the utilization of diseases.

【技术实现步骤摘要】
一种筛选大菱鲆饲料保护剂的方法
本专利技术属于水产养殖饲料
，具体涉及一种筛选大菱鲆的饲料保护剂的方法。
技术介绍
鱼类为人类提供了优质的蛋白源，对改善膳食营养结构、保障人类健康非常重要。随着社会发展，人民生活水平提高，健康意识日益增强，鱼产品需求量和消费量剧增。但鱼类养殖在蓬勃发展的同时，养殖水体污染和生态环境破坏问题不断凸显，造成鱼类疾病频繁暴发。究其原因在于鱼类生活在水中，为低等脊椎动物，消化能力和抗病力弱。其中肠道健康是鱼类健康养殖的关键，肠道是鱼类与外界环境接触面积最大的器官，因此是鱼类感染疾病的主要途径之一。鱼类肠道不仅是重要的消化和吸收器官，同时还具有免疫、内分泌以及新陈代谢的功能。肠道是鱼类最大的免疫器官，鱼类肠道健康对于鱼体的整体健康起到非常重要的作用。肠道健康下降，不仅导致机体健康下降，还降低营养物质消化吸收率，大量未消化营养物质排入水体，引起水环境污染，水质变差，进而降低鱼体健康水平，形成疾病频繁暴发。在陆生动物的研究表明，包括甘露寡糖、葡聚糖等在内的益生元以及包括谷氨酰胺、精氨酸等在内的氨基酸等肠道保护剂能够提高动物肠道健康水平及对营养物质的吸收，提高动物的免疫力以及抗病力。由于鱼类与高等陆生动物肠道结构、肠道生理功能的不同，在陆生动物中证明有效的饲料保护剂未必会对鱼类产生保护效果。因此需要通过建立筛选鱼类饲料肠道保护剂的方法，筛选鱼类专用饲料肠道保护剂，确定保护剂的使用剂量，从而减少鱼类疾病的发生，维持鱼类养殖业的健康可持续发展。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种筛选大菱鲆饲料保护剂的方法，可以有效的筛选对大菱鲆肠道健康有效的保护剂，以及其添加量。本专利技术首先提供一种筛选大菱鲆的饲料保护剂的标准，所述的标准是在大菱鲆饲料中添加保护剂后，肠道的指标变化包含如下一项或几项：1)大菱鲆肠体比的提高范围5.5±1.5％，肠道绒毛高度提高范围为8.5±4.5％，肠道吸收空泡高度提高范围为5.5±1.5％；2)大菱鲆肠道黏膜麦芽糖酶活力提高范围为32±6％、碱性磷酸酶活力提高范围为24±7％，亮氨酸氨基肽酶活力的提高范围为31±5％；3)大菱鲆肠道溶菌酶活力提高范围为38.5±21.5％，酸性磷酸酶活力提高范围为35±8％；4)大菱鲆肠道中丙二醛水平降低范围为30±12％，超氧化物歧化酶活力提高范围为25±5％，过氧化物酶活力提高范围为37±16％，谷胱甘肽过氧化物酶活力提高范围为33±14％；5)大菱鲆肠道中白细胞介素1β(IL-1β)基因表达量水平降低范围为33％-46％，白细胞介素(IL-8)基因表达量水平降低范围为58±15％，肿瘤坏死因子(TNF-α)基因表达量水平降低范围为63±24％。本专利技术再一个方面提供筛选适用于大菱鲆的饲料保护剂、保护剂的使用量的方法，是通过比较上述的标准来确定饲料保护剂是否有利于大菱鲆肠道健康；所述的方法，其一种筛选适用于大菱鲆的饲料保护剂，具体步骤如下：将需要筛选的保护剂添加到饲料中投喂给养殖鱼类，其中海水的溶氧在7.8-8.2mg/L，pH7.5-8.0，盐度28-30，温度14-16℃。每天投喂2次，分别在07:00、19:00，饱食投喂；养殖周期8周；饲养试验结束后，对指标进行检测，判断该保护剂是否有效。本专利技术可以用于鱼类肠炎保护剂的筛选，通过对组织、细胞、分子三个不同水平的考察，结合鱼类的肠道生理特点、肠道组织特点，保证了评价方法的系统性、全面性，所获得的结果能够为提高鱼类肠道健康、减少疾病发生的利用提供依据。具体实施方式下面结合实施案例对本专利技术进行详细的描述。实施例1：检测指标的筛选申请人发现，在饲料中以豆粕原料替代鱼粉会引起大菱鲆肠道健康水平的下降；通过在饲料中添加豆粕建立大菱鲆肠道亚健康模型，考查设定指标对反应大菱鲆肠道健康水平的敏感性，确定用于大菱鲆饲料保护剂筛选的指标，指标的筛选方法如下：以全鱼粉饲料作为对照饲料，以40％豆粕添加量替代鱼粉的饲料作为实验饲料，将两种不同的饲料投喂给养殖鱼类(表1)。养殖设施采用300L玻璃钢桶，每桶放养30尾大菱鲆鱼苗，起始重量7.5克左右。每个桶作为一个重复，每种饲料设三个重复。流水养殖，充气。在为期56天的养殖试验中，海水的溶氧在7.8-8.2mg/L，pH7.5-8.0，盐度28-30，温度14-16℃。每天投喂2次，分别在07:00、19:00，饱食投喂。养殖周期8周。表1饲料原料组成以及成分分析饲养试验结束后，随机抽取8尾鱼，称量体重后解剖获取肠道，称肠重后将肠道分成3部分。第一部分组织放置于4％的甲醛溶液中固定用于肠道组织光镜结构的观察；第二部分组织用液氮速冻用于黏膜消化酶活力检测；第三部分组织用液氮速冻用于免疫指标、氧化和抗氧化指标的测定。另随机抽取4尾鱼解剖获取肠道液氮速冻后用于消化酶活力的检测。养殖结束后，对大菱鲆的肠体比、肠道组织光镜结构、肠道黏膜消化酶活力(包括麦芽糖酶活力、碱性磷酸酶活力、亮氨酸氨基肽酶活力、胰蛋白酶活力、淀粉酶活力以及脂肪酶活力)、肠道免疫指标(包括溶菌酶活力、酸性磷酸酶活力)和氧化、抗氧化指标(包括丙二醛水平、一氧化氮水平、超氧化物歧化酶活力、过氧化物酶活力、谷胱甘肽过氧化物酶活力和谷胱甘肽转移酶活力)和炎性细胞因子指标(包括白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素-8(IL-8)、白细胞介素-22(IL-22)、肿瘤坏死因子(TNF-α)和转化生长因子-β(TGF-β))进行检测，通过比较摄食两种不同饲料鱼类上述指标的差异，筛选能够反应大菱鲆肠道健康水平的敏感性指标，确定用于大菱鲆饲料保护剂筛选的指标。检测指标的测定方法具体如下：1、肠体比的计算肠体比(ISI)＝鱼肠道重(g)/鱼体重(g)2、肠道组织光镜结构的观察肠道组织石蜡包埋切片采用常规制作方法，经H&E染色法染色后。显微镜下拍照，利用图像分析软件对肠道绒毛高度、肠道吸收空泡高度进行测量。3、肠道黏膜消化酶指标的测定肠道黏膜麦芽糖酶活力、碱性磷酸酶活力、亮氨酸氨基肽酶活力、胰蛋白酶活力、淀粉酶活力以及脂肪酶活力采用南京建成生物工程研究所试剂盒进行检测。4、肠道免疫指标用浊度分析法测定血浆中溶菌酶活性。即把0.1mL血浆添加到1.0mL0.2mg/mL溶壁微球菌悬液(在0.1M磷酸盐缓冲液(pH6.8)中)中。该反应在25℃下进行，分别在0.5和2.5min后用分光光度计测定530nm的吸光度。用冻干母鸡卵白溶菌酶制成的标准曲线测定溶菌酶数量。其特定活性表达为溶菌酶U/ml。肠道酸性磷酸酶活力的测定采用南京建城生物工程研究所试剂盒检测，并根据说明书进行测定。5、肠道氧化、抗氧化指标丙二醛水平、一氧化氮水平、超氧化物歧化酶活力、过氧化物酶活力、谷胱甘肽过氧化物酶活力和谷胱甘肽转移酶活力采用南京建城生物工程研究所试剂盒检测，并根据说明书进行测定。6、肠道炎性细胞因子指标需要测定的肠道炎性细胞因子指标包括白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素(IL-8)和肿瘤坏死因子(TNF-α)。cDNA的反转录采用QuantiTectReverseTranscriptionKit(Qiagen,205311)试剂盒。IL-1β的引物为5’-3’:GAGAGCATCGTGGAAGAACA3’-5本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种筛选大菱鲆的饲料保护剂的检测标准，其特征在于，所述的检测标准是在大菱鲆饲料中添加保护剂进行养殖后，肠道的指标变化，包含如下一项或几项：1)大菱鲆肠体比的提高范围5.5±1.5％，肠道绒毛高度提高范围为8.5±4.5％，肠道吸收空泡高度提高范围为5.5±1.5％；2)大菱鲆肠道黏膜麦芽糖酶活力提高范围为32±6％、碱性磷酸酶活力提高范围为24±7％，亮氨酸氨基肽酶活力的提高范围为31±5％；3)大菱鲆肠道溶菌酶活力提高范围为38.5±21.5％，酸性磷酸酶活力提高范围为35±8％；4)大菱鲆肠道中丙二醛水平降低范围为30±12％，超氧化物歧化酶活力提高范围为25±5％，过氧化物酶活力提高范围为37±16％，谷胱甘肽过氧化物酶活力提高范围为33±14％；5)大菱鲆肠道中白细胞介素1β基因表达量水平降低范围为33％‑46％，白细胞介素基因表达量水平降低范围为58±15％，肿瘤坏死因子基因表达量水平降低范围为63±24％。

【技术特征摘要】
1.一种筛选大菱鲆的饲料保护剂的检测标准，其特征在于，所述的检测标准是在大菱鲆饲料中添加保护剂进行养殖后，肠道的指标变化，包含如下一项或几项：1)大菱鲆肠体比的提高范围5.5±1.5％，肠道绒毛高度提高范围为8.5±4.5％，肠道吸收空泡高度提高范围为5.5±1.5％；2)大菱鲆肠道黏膜麦芽糖酶活力提高范围为32±6％、碱性磷酸酶活力提高范围为24±7％，亮氨酸氨基肽酶活力的提高范围为31±5％；3)大菱鲆肠道溶菌酶活力提高范围为38.5±21.5％，酸性磷酸酶活力提高范围为35±8％；4)大菱鲆肠道中丙二醛水平降低范围为30±12％，超氧化物歧化酶活力提高范围为25±5％，过氧化物酶活力提高范围为37±16％，谷胱甘肽过氧化物酶活力提高范围为33±14％；5)大菱鲆肠道中白细胞介素1β基因表达量水平降低范围为33％-46％，白细胞介素基因表...

【专利技术属性】
技术研发人员：谷珉，柳文爽，白楠，贾倩，潘世会，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：山东,37