一种一步沉积法修饰磁电极的蛋白质电化学印迹传感器的制备方法技术

本发明专利技术公开一种一步沉积法修饰磁电极的蛋白质电化学印迹传感器的制备方法，涉及电分析化学和蛋白质识别传感器技术领域。具体是1）石墨烯@Fe3O4纳米复合材料的制备；2）一步电沉积法制备石墨烯@Fe3O4@Au修饰磁电极：3）修饰磁电极表面引入硼酸、氨基、羧基活性基团，为蛋白质印迹提供多识别位点；4）预组装蛋白；5）电化学聚合蛋白质印迹膜；6）洗脱剂洗去模板蛋白，从而构建蛋白质分子印迹电化学传感器。本发明专利技术所制备的磁性修饰电极利于引入活性基团，增加识别位点，提高选择性，增加表面积，提高电极表面的导电性，所构建的蛋白质印迹电化学传感器，灵敏度高，可特异性识别目标蛋白，且可重复使用。

【技术实现步骤摘要】
一种一步沉积法修饰磁电极的蛋白质电化学印迹传感器的制备方法
本专利技术涉及一种一步沉积法修饰磁电极的蛋白质电化学印迹传感器的制备方法，涉及电分析化学和蛋白质识别传感器

技术介绍
生物识别元素，如酶、抗体，适配体等，近年来在生物传感器的发展中得到了广泛应用。然而虽然这些识别元素对目标分析物具有良好的识别能力，但是由于它们在自然环境下的不稳定，使用条件苛刻，制备繁琐等特点，从而限制了它们的应用。为克服了这些缺点，分子印迹聚合物（MIPs）作为新型的生物识别元素，具有稳定性高，价格低廉，可重复利用，容易制备等特点，已成为理想的仿生材料。分子印迹技术，又称分子模板技术或者是分子烙印技术，是模拟自然界所存在的分子识别作用，制备包裹模板分子的聚合物网状结构的人工受体，它是涉及高分子化学、生物化学、材料化学等学科的一种用于分离纯化的先进技术。MIPs是一种空穴大小、形状，和功能基团与模板分子相匹配的聚合物，对模板分子具有特异性识别能力，可用于目标分子的分离、富集、定性和定量分析。它的先进之处就在于它的预定性、特异识别性、广泛实用性，在天然产物纯化、临床药物分析、色谱中对映体和异构体的分离、化学仿生传感器、固相萃取、模拟酶催化、膜分离技术等领域具有广泛应用。分子印迹电化学传感器(MIECS)结合了分子印迹技术及电化学传感器的优点，表现出高灵敏度、化学和机械稳定性、可重复利用、操作简单、廉价等特点，因此在医药、生物、环境等领域得到了广泛应用。MIECS已被成功用于识别各种小分子，然而对于印迹一些分子量较大的分子，如生物大分子尤其是蛋白质，仍具有非常大的挑战性。由于蛋白质的特殊性质，如大的分子尺寸，易变的空间结构，大量的用于识别的官能团（氨基、羧基等），针对这些特殊性质，为提高蛋白质MIECS的选择性和灵敏度，新的技术与方法应运而生，主要包括聚合物材料的选择和电极修饰的新方法。聚合物材料的选择是有效印迹模板蛋白的一个重要因素，具有生物相容性的丙烯酰胺体系能够在水相环境中产生聚合反应，因此在蛋白质印迹技术中得到了深入研究和成功应用；电极修饰新方法在于提高电极表面的传导性、表面积、引入的活性基团提高识别性。关于蛋白质MIECS的研究报道日益增多，在各种MIECS中，最为有效的方式就是电极表面修饰技术，为最大限度地改善电极表面的电导性和放大表面积。改善导电性可以提高电化学信号，放大表面积有利于表面形成更多的印迹洞穴，从而提高对模板蛋白的吸附能力。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种一步沉积法修饰磁电极的蛋白质电化学印迹传感器的制备方法，用于目标蛋白的识别与检测。本专利技术采用一步沉积法将石墨烯@Fe3O4与Au共掺杂沉积到磁电极表面，这种修饰方法利用磁电极对石墨烯@Fe3O4材料的磁场吸附作用，石墨烯@Fe3O4@Au可以牢固地结合到电极表面，修饰电极性质稳定，组装的纳米材料不易脱落，从而提高电极表面的电导性和表面积，利于后期分子印迹膜的制备，提高MIECS的灵敏度。接着以蛋白质为模板分子，电化学诱导的丙烯酰胺和N,N’-甲叉双丙烯酰胺共聚合反应，形成分子印迹聚合物层，洗去模板分子，构建蛋白质MIECS。所构建的蛋白质MIECS对目标蛋白的识别具有较宽的动态范围，较高的灵敏度，良好的选择性和重复利用性，满意的稳定性，且廉价，易制备，可用于目标分子的识别与检测。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：所述一种一步沉积法修饰磁电极的蛋白质电化学印迹传感器的制备方法，具体步骤如下：1)石墨烯@Fe3O4纳米材料的制备：石墨烯粉末分散在40g乙二醇溶液中，超声分散，依次添加0.2gFeCl3·6H2O,1.8g乙酸钠，0.8gPEG20000，充分溶解，转移到50mL反应釜中，水热反应一段时间；所得磁性石墨烯@Fe3O4纳米材料，磁场分离，依次用乙醇、纯水清洗数遍，60℃烘干；2）一步电沉积法制备石墨烯@Fe3O4@Au修饰磁电极：经打磨好的电极插入含磁性石墨烯@Fe3O4纳米材料的HAuCl4弱碱性缓冲溶液中，-1.4～0.6V范围循环伏安扫描，超纯水淋洗修饰电极；3）修饰磁电极表面功能化：将步骤2）所制备的修饰电极浸泡于含巯基化合物的混合溶液中，自组装一段时间，取出电极，超纯水淋洗，静置，干燥；4）预组装蛋白：将步骤3）所制备的修饰电极浸泡于蛋白质溶液中，自组装一段时间，取出电极，超纯水淋洗，静置，干燥；5）电化学聚合蛋白质印迹膜：22.5mg丙烯酰胺，3mg甲叉双丙烯酰胺，5mg蛋白质,2mg过硫酸铵溶解于1mL弱碱性缓冲溶液中，将步骤4）所制备的修饰电极浸泡于该混合溶液中，-0.4～0.4V范围循环伏安扫描，超纯水淋洗修饰电极；6)将步骤5）所制备的修饰电极浸泡于洗脱液中，洗去模板蛋白，取出电极，超纯水淋洗，静置，干燥，得到蛋白质印迹电极；7）将步骤6）所制备的蛋白质印迹电极，浸泡于不同样品溶液中，吸附一段时间，取出电极，超纯水淋洗，静置，干燥，于于含0.1mol/LKCl,5mmol/L的铁氰化钾溶液中扫描，监测峰电流的变化，从而构建蛋白质分子印迹传感器。在步骤1）中所用石墨烯为单层片状羧基化石墨烯，用量为：20～80mg,水热反应温度为100～260℃，反应时间5～20h。在步骤2）中所用的电极为磁性玻碳电极（直径=4mm）,石墨烯@Fe3O4纳米材料的浓度为：0.05～0.5mg/mL,氯金酸的质量浓度为：0.1～1.0%，扫描圈数：3～10圈，扫速：5～100mV/s，弱碱性溶液pH值为：7～10。在步骤3）巯基化合物混合溶液含巯基苯硼酸和半胱氨酸，两者摩尔比为1:1，两者摩尔浓度均为：10～30mmol/L,电极自组装时间为：5～60min。在步骤4）中的蛋白质为牛血红蛋白、牛血清白蛋白、溶菌酶、卵清白蛋白中的一种，自组装时间为：10～60min。在步骤5）中扫描圈数：3～10圈，扫速：5～100mV/s，弱碱性溶液pH值为：7～10。在步骤6）中所用的洗脱液为10wt%SDS，1mol/LNaCl，10vol%乙酸，5wt%SDS与5vol%乙酸混合液中的一种。在步骤7）中吸附时间为30～120min，峰电流采用差分脉冲伏安法（DPV）检测，DPV扫描范围-0.2～0.6V。电化学分析采用常规的三电极系统：分子印迹聚合物修饰的磁性玻碳电极为工作电极，铂丝为辅助电极，Ag/AgCl电极为参比电极。本专利技术的显著优点在于：1）本专利技术所用的磁性石墨烯@Fe3O4材料制备简单，消耗量少，石墨烯的片状结构利于电极表面的修饰，磁性材料与磁电极结合，利于吸附到电极表面；2）采用一步沉积法将石墨烯@Fe3O4与Au共掺杂沉积到磁电极表面，这种修饰方法利用磁电极对石墨烯@Fe3O4材料的磁场吸附作用，石墨烯@Fe3O4@Au可以牢固地结合到电极表面，修饰电极性质稳定，组装的纳米材料不容易脱落，从而提高电极表面的电导性和表面积，利于后期分子印迹膜的制备，提高MIECS的灵敏度。3）所制备的磁性修饰电极引入硼酸、氨基、羧基活性基团，增加识别位点，利于构建多识别位点的分子印迹聚合物膜；4）所构建的蛋白质印迹电化学传感器，灵敏度高，可特异性识别目标蛋白，且可重复使用，可用于目标蛋白的识别与检测。附图说明图1蛋白质分子印迹电化学传本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种一步沉积法修饰磁电极的蛋白质电化学印迹传感器的制备方法，其特征在于：首先制备石墨烯@Fe3O4纳米复合材料；再一步电沉积法制备石墨烯@Fe3O4@Au修饰磁电极：然后修饰磁电极表面引入硼酸、氨基、羧基活性基团，为蛋白质印迹提供多识别位点；接着预组装蛋白；采用电化学聚合法制备蛋白质印迹聚合物膜；模板蛋白经洗脱，从而构建蛋白质分子印迹电化学传感器。

【技术特征摘要】
1.一种一步沉积法修饰磁电极的蛋白质电化学印迹传感器的制备方法，其特征在于：首先制备石墨烯@Fe3O4纳米复合材料；再一步电沉积法制备石墨烯@Fe3O4@Au修饰磁电极：然后修饰磁电极表面引入硼酸、氨基、羧基活性基团，为蛋白质印迹提供多识别位点；接着预组装蛋白；采用电化学聚合法制备蛋白质印迹聚合物膜；模板蛋白经洗脱，从而构建蛋白质分子印迹电化学传感器。2.根据权利要求1所述的一种一步沉积法修饰磁电极的蛋白质电化学印迹传感器的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：1)石墨烯@Fe3O4纳米材料的制备：石墨烯粉末分散在40g乙二醇溶液中，超声分散，依次添加0.2gFeCl3·6H2O,1.8g乙酸钠，0.8gPEG20000，充分溶解，转移到50mL反应釜中，水热反应一段时间；所得磁性石墨烯@Fe3O4纳米材料，磁场分离，依次用乙醇、水清洗数遍，60℃烘干；2）一步电沉积法制备石墨烯@Fe3O4@Au修饰磁电极：经打磨好的电极插入含磁性石墨烯@Fe3O4纳米材料的HAuCl4弱碱性缓冲溶液中，-1.4～0.6V范围循环伏安扫描，超纯水淋洗修饰电极；3）修饰磁电极表面功能化：将步骤2）所制备的修饰电极浸泡于含巯基化合物的混合溶液中，自组装一段时间，取出电极，超纯水淋洗，静置，干燥；4）预组装蛋白：将步骤3）所制备的修饰电极浸泡于蛋白质溶液中，自组装一段时间，取出电极，超纯水淋洗，静置，干燥；5）电化学聚合蛋白质印迹膜：22.5mg丙烯酰胺，3mg甲叉双丙烯酰胺，5mg蛋白质,2mg过硫酸铵溶解于1mL弱碱性缓冲溶液中，将步骤4）所制备的修饰电极浸泡于该混合溶液中，-0.4～0.4V范围循环伏安扫描，超纯水淋洗修饰电极；6)将步骤5）所制备的修饰电极浸泡于洗脱液中，洗去模板蛋白，取出电极，超纯水淋洗，静置，干燥，得到蛋白质印迹电极；7）将步骤6）所制备的蛋白质印迹电极，浸泡于不同样品溶液中，吸附一段时间，取出电极，超纯水淋洗，静置，干燥，于含0.1mol/LKCl,...

【专利技术属性】
技术研发人员：李艳霞，林兴乐，赖嘉嘉，钱承秀，
申请(专利权)人：闽江学院，
类型：发明
国别省市：福建,35