一种调控杨树不定根和木质部发育的关键基因PeRBR及其表达蛋白和应用制造技术

本发明专利技术公开了一种杨树不定根和木质部发育的关键基因PeRBR及其表达蛋白和应用，该关键基因PeRBR的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明专利技术通过将PeRBR基因转入杨树，过量表达PeRBR基因的转基因杨树不定根长度增加、侧根数目增多，而且不定根和茎的木质部厚度都明显增加。这表明PeRBR基因是杨树不定根和木质部发育的关键调节因子，在林木无性系育种和提高木材产量等方面有重要的应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种调控杨树不定根和木质部发育的关键基因PeRBR及其表达蛋白和应用
本专利技术属于植物基因工程
，具体涉及一种调控杨树不定根和木质部发育的关键基因PeRBR及其表达蛋白和应用。
技术介绍
杨树是我国重要的速生工业用材树种和绿化造林树种，尽管大多数杨树都比较容易扦插生根，然而仍有许多优良无性系扦插生根困难。因此开展杨树不定根发生发育的分子机理研究不仅具有重要的理论意义，而且蕴含潜在应用价值。然而，植物不定根的发育调控十分复杂，会受多重内源激素或环境因素的影响。因此，目前仅有少量基因被鉴定参与调控不定根发生，整个不定根发育的分子机理还十分薄弱。另外，木质部的形成和发育直接影响到林木的木材质量和产量，因此有关木质部形成和发育的研究也一直是林木育种的研究的重点，但是由于木质部形成和发育的机理十分复杂，到目前为止，在杨树中的相关研究还很有限。成视网膜细胞瘤蛋白(retinoblastoma，RB)是一类在多种肿瘤组织中表达的肿瘤抑制蛋白，最先在人体中被分离和鉴定。RB蛋白具有两个高度保守的结构域，分别为A、B框，它们之间可以相互作用，在C端形成一种类似于口袋状的结构，这个口袋区是RB蛋白与转录因子的结合区域，因此RB蛋白也被称为“口袋蛋白”。在细胞发育的不同阶段中，RB蛋白都起着十分重要的作用，是细胞分化、基因表达控制和细胞凋亡等很多细胞事件的重要调节者。随着研究的深入，研究人员发现RB蛋白不仅存在于脊椎动物中，在多种真核细胞生物中均发现了它们的存在。在植物中，RBR(RB-related)基因最早在玉米中发现并且成功克隆出来。随后，拟南芥、烟草、水稻等植物中也相继克隆出RBR基因。在氨基酸序列的A区与B区中，植物RBR基因与动物RB基因的同源性为20-35％，具有一定的保守性，这说明二者在生物化学特性上具有相似性。此外，在植物的各个组织中均发现了RBR基因，但表达量各不相同，且不同的发育发育时期表达量也不同，这点与RB蛋白相同，说明RB/RBR蛋白具有较高的保守性，RBR功能的研究可以借鉴RB蛋白。研究发现，RBR/rbr杂合拟南芥只有和正常父本杂交才能产生后代，但败育率较高，说明RBR基因的突变对母本植株花粉的产生具有重要影响。而通过对败育胚珠的研究，发现，RBR基因功能的缺失会引起雌配子发育紊乱，这表明在受精卵形成前，RBR基因已经发挥着重要作用。在雌配子体发育过程中，母细胞经有丝分裂后会形成含有七个细胞以及八个细胞核的胚囊结构，而在受精前，rbr基因型的雌配子形成的胚囊中的细胞核多于八个，细胞分裂不完全，多出的细胞核聚集在珠孔中阻碍花粉管进入。此外，在雌配子发育时，rbr基因型出现基因异常表达现象。这些研究表明雌性器官在没有受精前，RBR基因能够抑制细胞有丝分裂。拟南芥中RBR基因功能缺失后，会出现有丝分裂规律紊乱、雌雄配体发育异常，这些现象表明RBR基因在细胞分裂、增殖中具有重要作用。研究发现，RBR-RNAi(rRBr)植株中抑制了RBR转录之后，根冠部多出了未分化的细胞，这部分细胞由于无淀粉体，因此它们保有了干细胞的特点。切除rRBr植株的根尖静止中心细胞后，未分化的细胞进行分化，对野生型植株进行相同部位的切除后干细胞四周的细胞也会进行分化，这一结果显示根尖分生组织缺失了RBR基因的功能之后，能够增加根尖干细胞的面积，增强静止中心的信号，保持干细胞的特性。有研究显示，部分能够使细胞保持静止中心状态的基因可以和RBR基因进行相互作用，从而维持根尖分生组织内的干细胞巢，抑制了干细胞进行提早分化。经过以上研究可以得出结论：RBR基因对于维持干细胞分裂分化、增殖等方面起着关键的作用。叶片发育是植物生长发育中的一个重要环节。在叶形成的早期阶段，叶原基由初生分生组织细胞经一系列复杂的转录因子网络调控产生，随后在多个转录因子的调控下，叶原基沿叶轴生长，经增殖、分裂等过程之后，叶片最终形成伸展的叶形。研究发现，烟草中抑制RBR1基因的表达后，烟草会产生发育变缓、植株矮小、叶片卷缩明显等现象，更深入的研究结果显示，叶片中细胞数增多，推测叶片之所以发生异常发育，原因是细胞增殖活动过于旺盛。此外，还影响了表皮上气孔的排列。拟南芥中的研究显示，RBR基因在叶片发育中起抑制细胞增殖的作用。虽然在拟南芥等草本模式植物中已结对RBR基因进行了较为深入的研究，但是在木本植物中很少有相关具有针对性、系统性的深入研究报道阐述其作用机制。
技术实现思路
专利技术目的：针对现有技术中存在的不足，本专利技术的目的是提供一种杨树不定根发育关键基因PeRBR，满足杨树不定根和木质部发育的使用需求。本专利技术的另一目的是提供一种是上述杨树不定根发育关键基因PeRBR的表达蛋白。本专利技术还有一目的是提供一种上述杨树不定根发育关键基因PeRBR的应用。技术方案：为了实现上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案如下：一种调控杨树不定根和木质部发育关键基因PeRBR，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。所述的杨树不定根和木质部发育关键基因PeRBR的表达蛋白，其氨基酸序列如SEQNO.2所示。含有所述的杨树不定根和木质部发育关键基因PeRBR的载体。所述的载体，在PeRBR基因的5’端组装组成型强表达启动子P35S。所述的载体，在PeRBR基因的3’端组装了强终止子NOS。所述的载体，组装HPT基因表达盒，作为转基因杨树的筛选标记，可以用潮霉素进行转基因杨树的筛选。所述的载体，组装LB和RB序列，促使组装于其间的PeRBR基因表达框架和筛选标记基因HPT整合至杨树受体细胞染色体中。含有所述的杨树不定根和木质部发育关键基因PeRBR的宿主细胞。所述的杨树关键基因PeRBR在调控杨树不定根和木质部发育中的应用。本专利技术以南林895杨初生不定根为材料，通过RACE技术克隆了PeRBR基因。同时，采用Gateway克隆技术构建其杨树过量表达载体pH35GS-PeRBR，该基因位于启动子P35S之后，在启动子P35S的驱动下，PeRBR可在杨树体内高效表达，从而调控不定根和木质部的形成和发育。其中，所PeRBR基因是杨树不定根发生发育关键基因。有益效果：与现有技术相比，本专利技术通过将PeRBR基因转入杨树，过量表达PeRBR基因的转基因杨树不定根长度增加、侧根数目增多，而且不定根和茎的木质部厚度都明显增加。这表明PeRBR基因是杨树不定根和木质部发育的关键调节因子，在林木无性系育种和提高木材产量等方面有重要的应用价值。不仅为杨树分子育种提供了理论基础，而且还能促进杨树的优良品系的繁育，对林业发展有着巨大的经济价值。附图说明图1是植物表达载体pH5GS的结构示意图；图2是过量表达PeRBR基因的实时定量分子检测结果图；图3是过量表达PeRBR基因的转基因杨与未转基因杨(CK)的整体形态比较结果图；图4是过量表达PeRBR基因的转基因杨与未转基因杨(CK)的根形态比较结果图；图5是过量表达PeRBR基因的转基因杨与未转基因杨(CK)的不定根长度比较结果图；图6是过表达PeRBR转基因杨与未转基因杨(CK)的根、茎结构比较结果图；图中4WR和5WR指4周和5周的根，5WS指5周的茎。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术做进一步的说明。实施例1通过RACE技术克隆PeRBR基本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种调控杨树不定根和木质部发育关键基因PeRBR，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种调控杨树不定根和木质部发育关键基因PeRBR，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。2.权利要求1所述的杨树不定根和木质部发育关键基因PeRBR的表达蛋白，其氨基酸序列如SEQNO.2所示。3.含有权利要求1所述的杨树不定根和木质部发育关键基因PeRBR的载体。4.根据权利要求3所述的载体，其特征在于：所述载体在PeRBR基因的5’端组装组成型强表达启动子P35S。5.根据权利要求3所述的载体，其特征在于：所述载体在PeRBR基因的3’端组装了强...

【专利技术属性】
技术研发人员：胥猛，刘思安，朱瑶瑶，徐立安，
申请(专利权)人：南京林业大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32