一种通过多能干细胞分化获得具有吞噬功能的巨噬细胞的方法技术

本发明专利技术涉及细胞培养技术领域，具体而言，提供了一种通过多能干细胞分化获得具有吞噬功能的巨噬细胞的方法。该细胞诱导培养基可以实现拟胚体细胞快速、大量地诱导分化成巨噬细胞。其中，前六种培养基包括无血清培养基，利用无血清培养基可以提供细胞各个阶段生长、增殖和分化所用的基础营养物质，又避免引入外源性物质，降低污染风险。第七培养基中含有血清，同时额外添加了FBS，可以很好的维持巨噬细胞的生长。每种培养基中又各自含有多种细胞因子能够促进细胞的定向分化。本发明专利技术提供的细胞诱导培养方法，简单高效、成本低、短周期内可大量扩增得到高质量高纯度的巨噬细胞，对于临床治疗和研究具有重要的意义。

【技术实现步骤摘要】
一种通过多能干细胞分化获得具有吞噬功能的巨噬细胞的方法
本专利技术涉及细胞培养
，具体而言，涉及一种通过多能干细胞分化获得具有吞噬功能的巨噬细胞的方法。
技术介绍
巨噬细胞是机体重要的免疫细胞之一，在大部分组织和器官中都有分布，在非特异性免疫中清除细菌、病毒、真菌病原体和特异性免疫应答中起抗原提呈和产生相应细胞因子的作用。且巨噬细胞是一种多分化来源的细胞，单核细胞、CD34+造血干细胞、早期的T淋巴细胞等在一定条件下都可以分化为巨噬细胞。目前，体外实验所用人类巨噬细胞主要有两种来源途径，一种是肿瘤来源的细胞系，如U937和THP-1等细胞系；另一种是原代细胞如外周血单核细胞来源的巨噬细胞。前者来源的巨噬细胞具有无限复制的潜能，在巨噬细胞相关生物学研究中发挥了重要的作用，但同原代巨噬细胞相比，这些永生化的细胞系容易发生非正常的遗传结构改变，导致功能的缺失，严重限制了其在相关研究中的应用。而来源于外周血的巨噬细胞能够代表组织巨噬细胞，但是因其不能自我更新，每次研究需要从供者体内采取大量血液，且因供者的生理状态和基因等的不同，导致试验结果不具代表性。诱导性多能干细胞(iPS)在体外能够诱导分化为巨噬细胞。iPS分化而来的巨噬细胞对于建立基因特异的iPS驱动终末分化、正常核型以及同供体保持基因一致性方面提供了有力的替代系统。特别是研究人类疾病基因位点的巨噬细胞特异性功能以及体内平衡、疾病状态和治疗转化中人巨噬细胞生物学新机制提供了潜在的工具。iPS技术的出现不仅避免了干细胞研究在伦理道德上的限制，还由于来源丰富、获取相对容易及能获得个体特异性的iPS等优点，受到广泛的关注，并得到迅速的发展。但iPS向免疫细胞，尤其是巨噬细胞分化的机制尚不明确，且诱导的效率较低，因此，开发出一种iPS可以高效，稳定，大量的获得巨噬细胞的诱导方法具有重要意义。有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的第一目的在于提供一组细胞诱导培养基，本专利技术的第二目的在于提供一种细胞诱导培养方法，本专利技术的第三目的在于提供上述细胞诱导培养基或细胞诱导培养方法在诱导性多能干细胞或拟胚体诱导分化成巨噬细胞中的应用，本专利技术的第四目的在于提供一种包含上述细胞诱导培养基的用于诱导性多能干细胞或拟胚体诱导分化成巨噬细胞的试剂盒，以缓解现有技术中巨噬细胞来源少，细胞数量低或者品质无法保证，iPS诱导分化方法不成熟的技术问题。为了实现本专利技术的上述目的，特采用以下技术方案：本专利技术提供一组细胞诱导培养基，所述细胞诱导培养基包括：第一培养基、第二培养基、第三培养基、第四培养基、第五培养基、第六培养基和第七培养基；所述第一培养基包括第一基础培养基和第一细胞因子；所述第二培养基包括第一基础培养基和第二细胞因子；所述第三培养基包括第一基础培养基和第三细胞因子；所述第四培养基包括第二基础培养基和第三细胞因子；所述第五培养基包括第二基础培养基和第四细胞因子；所述第六培养基包括第二基础培养基和第五细胞因子；所述第七培养基包括第三基础培养基、第六细胞因子和FBS；其中，所述第一基础培养基和第二基础培养基为无血清培养基；所述第三基础培养基为含血清培养基；所述第一细胞因子包括BMP4和bFGF；所述第二细胞因子包括BMP4，bFGF，VEGF和SCF；所述第三细胞因子包括bFGF，VEGF，SCF，IGF1，IL-3，M-CSF和GM-CSF；所述第四细胞因子包括bFGF，VEGF，SCF，IGF1，IL-3，M-CSF和GM-CSF；所述第五细胞因子包括bFGF，VEGF，SCF，IGF1，M-CSF和GM-CSF；所述第六细胞因子包括M-CSF和GM-CSF。进一步地，第一基础培养基为STEMdiffTMAPELTM2或mTeSR1；和/或，第二基础培养基为StemProTM-34；和/或，第三基础培养基为RPMI-1640。进一步地，所述第一培养基中，所述BMP4和bFGF的终浓度依次为8-12ng/ml和3-7ng/ml；和/或，所述第二培养基中，所述BMP4，bFGF，VEGF和SCF的终浓度依次为8-12ng/ml、3-7ng/ml、48-52ng/ml和95-105ng/ml；和/或，所述第三培养基中，所述bFGF，VEGF，SCF，IGF1，IL-3，M-CSF和GM-CSF的终浓度依次为8-12ng/ml、48-52ng/ml、48-52ng/ml、8-12ng/ml、23-27ng/ml、48-52ng/ml和48-52ng/ml；和/或，所述第五培养基中，所述bFGF，VEGF，SCF，IGF1，IL-3，M-CSF和GM-CSF的终浓度依次为8-12ng/ml、48-52ng/ml、48-52ng/ml、8-12ng/ml、23-27ng/ml、95-105ng/ml和95-105ng/ml；和/或，所述第六培养基中，所述bFGF，VEGF，SCF，IGF1，M-CSF和GM-CSF的终浓度依次为8-12ng/ml、48-52ng/ml、48-52ng/ml、8-12ng/ml、95-105ng/ml和95-105ng/ml；和/或，所述第七培养基中，所述FBS，M-CSF和GM-CSF的终浓度依次为质量分数8-12％、95-105ng/ml和95-105ng/ml；优选地，所述第七培养基中，所述FBS经过灭活处理。本专利技术提供一种细胞诱导培养方法，应用上述细胞诱导培养基，包括以下步骤：将细胞放置在第一培养基中进行第一阶段培养，然后在第二阶段、第三阶段、第四阶段、第五阶段、第六阶段和第七阶段依次用第二培养基、第三培养基、第四培养基、第五培养基、第六培养基和第七培养基进行培养；所述第一阶段为接种后0-1天，所述第二阶段为接种后2-7天，所述第三阶段为接种后8-10天，第四阶段为接种后10-20天，第五阶段为接种后20-22天，第六阶段为接种后22-28天，第七阶段为接种后第29天。进一步地，所述第二阶段培养时需要每隔一天更换新的第二培养基；优选地，所述第三阶段培养时需要每隔一天更换新的第三培养基；优选地，所述第五阶段进行培养的细胞为所述第四阶段培养后得到的悬浮细胞。进一步地，所述第四阶段、第五阶段、第六阶段和第七阶段进行培养时均需要提供基质胶；优选地，所述基质胶包括Matrigel或Laminin-521。进一步地，所述细胞为拟胚体；优选地，所述细胞经过细胞诱导培养方法培养得到巨噬细胞。进一步地，所述拟胚体由诱导性多能干细胞得到；优选地，诱导性多能干细胞中加入细胞消化液Accutase并在36-38℃条件下孵育10-14h得到拟胚体；优选地，诱导性多能干细胞经Rock激酶抑制剂Y27632处理后再加入细胞消化液Accutase并在36-38℃条件下孵育10-14h得到拟胚体。本专利技术又提供上述细胞诱导培养基或细胞诱导培养方法在诱导性多能干细胞或拟胚体诱导分化成巨噬细胞中的应用。本专利技术最后提供一种包括上述细胞诱导培养基的用于诱导性多能干细胞或拟胚体诱导分化成巨噬细胞的试剂盒。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：本专利技术提供一组细胞诱导培养基，包括七种培养基。该细胞诱导培养基可以实现拟胚体细胞快速、大量地诱导分化成巨噬细胞。其中，前六种培养基包括无血清培养本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一组细胞诱导培养基，其特征在于，所述细胞诱导培养基包括：第一培养基、第二培养基、第三培养基、第四培养基、第五培养基、第六培养基和第七培养基；所述第一培养基包括第一基础培养基和第一细胞因子；所述第二培养基包括第一基础培养基和第二细胞因子；所述第三培养基包括第一基础培养基和第三细胞因子；所述第四培养基包括第二基础培养基和第三细胞因子；所述第五培养基包括第二基础培养基和第四细胞因子；所述第六培养基包括第二基础培养基和第五细胞因子；所述第七培养基包括第三基础培养基、第六细胞因子和FBS；其中，所述第一基础培养基和第二基础培养基为无血清培养基；所述第三基础培养基为含血清培养基；所述第一细胞因子包括BMP4和bFGF；所述第二细胞因子包括BMP4，bFGF，VEGF和SCF；所述第三细胞因子包括bFGF，VEGF，SCF，IGF1，IL‑3，M‑CSF和GM‑CSF；所述第四细胞因子包括bFGF，VEGF，SCF，IGF1，IL‑3，M‑CSF和GM‑CSF；所述第五细胞因子包括bFGF，VEGF，SCF，IGF1，M‑CSF和GM‑CSF；所述第六细胞因子包括M‑CSF和GM‑CSF。

【技术特征摘要】
1.一组细胞诱导培养基，其特征在于，所述细胞诱导培养基包括：第一培养基、第二培养基、第三培养基、第四培养基、第五培养基、第六培养基和第七培养基；所述第一培养基包括第一基础培养基和第一细胞因子；所述第二培养基包括第一基础培养基和第二细胞因子；所述第三培养基包括第一基础培养基和第三细胞因子；所述第四培养基包括第二基础培养基和第三细胞因子；所述第五培养基包括第二基础培养基和第四细胞因子；所述第六培养基包括第二基础培养基和第五细胞因子；所述第七培养基包括第三基础培养基、第六细胞因子和FBS；其中，所述第一基础培养基和第二基础培养基为无血清培养基；所述第三基础培养基为含血清培养基；所述第一细胞因子包括BMP4和bFGF；所述第二细胞因子包括BMP4，bFGF，VEGF和SCF；所述第三细胞因子包括bFGF，VEGF，SCF，IGF1，IL-3，M-CSF和GM-CSF；所述第四细胞因子包括bFGF，VEGF，SCF，IGF1，IL-3，M-CSF和GM-CSF；所述第五细胞因子包括bFGF，VEGF，SCF，IGF1，M-CSF和GM-CSF；所述第六细胞因子包括M-CSF和GM-CSF。2.根据权利要求1所述的细胞诱导培养基，其特征在于，第一基础培养基为STEMdiffTMAPELTM2或mTeSR1；和/或，第二基础培养基为StemProTM-34；和/或，第三基础培养基为RPMI-1640。3.根据权利要求1所述的诱导培养基，其特征在于，所述第一培养基中，所述BMP4和bFGF的终浓度依次为8-12ng/ml和3-7ng/ml；和/或，所述第二培养基中，所述BMP4，bFGF，VEGF和SCF的终浓度依次为8-12ng/ml、3-7ng/ml、48-52ng/ml和95-105ng/ml；和/或，所述第三培养基中，所述bFGF，VEGF，SCF，IGF1，IL-3，M-CSF和GM-CSF的终浓度依次为8-12ng/ml、48-52ng/ml、48-52ng/ml、8-12ng/ml、23-27ng/ml、48-52ng/ml和48-52ng/ml；和/或，所述第五培养基中，所述bFGF，VEGF，SCF，IGF1，IL-3，M-CSF和GM-CSF的终浓度依次为8-12ng/ml、48-52ng/ml、48-52ng/ml、8-12ng/ml、23-27ng/ml、95-105ng/ml和95-105ng/ml；和/或，所述第...

【专利技术属性】
技术研发人员：张进，张丽，
申请(专利权)人：张进，
类型：发明
国别省市：浙江,33