基因HES2在食管鳞癌辅助诊断、预后判断和治疗中的应用制造技术

本发明专利技术公开了基因HES2在食管鳞癌辅助诊断、预后判断和治疗中的应用。本发明专利技术发现HES2基因高表达于食管鳞癌组织。进一步实验发现HES2基因的mRNA在食管鳞癌细胞系高表达，HES2高表达者肿瘤进展更快且更倾向于发生淋巴结或远处器管转移，与较差的5年无病生存率和5年总体生存率显著相关。另外还设计针对HES2基因的反义寡核苷酸链序列，沉默HES2表达，可用于食管癌的治疗。说明HES2可作为食管鳞癌辅助诊断及预测食管鳞癌复发趋势的检测标志物，以及治疗的靶点。

【技术实现步骤摘要】
基因HES2在食管鳞癌辅助诊断、预后判断和治疗中的应用
本专利技术涉及分子生物学和肿瘤药物领域，具体涉及一种食管鳞状细胞癌标志物HES2及其在食管鳞状细胞癌辅助诊断、治疗和预后判断中的应用。
技术介绍
食管癌是常见的恶性肿瘤，据2012年全球肿瘤统计，全世界估计有45.58万新的食管癌病例。我国是世界上食管癌高发地区之一，发病率约占全球50％，每年平均病死约15万人。食管癌的发病率和死亡率各国差异很大，全世界每年约有30万人死于食管癌。我国已成为全球患食管癌死亡率最高的国家。大约有一半被诊断患有食管癌的病例存在不能切除或转移的肿瘤。大部分患者在发现时已发展到局部晚期(30％)或晚期(40％)。这两组患者的5年生存率为39％和4％。食管癌主要有鳞状细胞癌和腺癌两种类型，其中鳞癌最为常见，约占全球食管癌的90％。为了更高效地识别高危肿瘤和更准确地预测高危肿瘤的发展趋势，发现并合理应用肿瘤标志物是肿瘤检测和复发预测的前提。目前，预测早期复发以及预后不佳的食管癌的标志物尚不成熟，而且帮助新发病例了解疾病进展风险和指导治疗的工具也十分有限。因此，食管癌复发标志物的研究己成为迫切需要解决的重大科研问题。HES家族基因是再生医学和肿瘤学领域的药物基因组靶标。HES2是HES家族bHLH转录因子2，其基因位于人类基因组序列AL031848.il中，编码173-aa蛋白。有研究表明，HES2可与转录起始复合物相互作用并抑制其功能，可能参与各种基因的调控，并可能在细胞分化中起作用。另外，HES2mRNA在胎盘，胰腺癌，RER结肠癌，宫颈癌和头颈部肿瘤中表达。反基因治疗(anti-genetherapy)是由特定寡聚脱氧核苷酸与靶双链DNA同聚嘧啶或同聚嘌呤区专一性结合形成局部三螺旋结构，通过阻止靶DNA与聚合酶、转录因子等蛋白结合而实现抑制靶基因的复制和表达的目的。反义寡核苷酸(AON)是一类通过序列特异地与靶基因DNA或mRNA结合而抑制该基因表达,在基因水平调控的分子药物。目前比较理想的反义物质——锁核酸(lockmucleicacid,LNA)是一种特殊的双环状核苷酸衍生物，与其他寡核苷酸相比，具有热稳定性更高、分子杂交能力更好、抗核酸酶降解能力更强、脂溶性更好和细胞毒性更低等优势。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种用于食管鳞癌辅助诊断或/和预后诊断的产品。本专利技术的另一目的在于提供一种治疗食管鳞癌的药剂。本专利技术所采取的技术方案是：定量检测HES2的试剂在制备食管鳞癌辅助诊断或/和预后诊断产品中的应用。进一步的，所述定量检测HES2的试剂选自定量检测HES2的RNA转录水平的试剂、定量检测HES2的蛋白表达水平的试剂中的至少一种。进一步的，所述定量检测HES2的RNA转录水平的试剂选自定量检测HES2的引物或探针。进一步的，所述定量检测HES2的引物为：上游引物：5'-AACCAGAGCCTGAGCCAGCTTA-3'(SEQIDNO:1)；下游引物：5'-TGCAGGAAGCGCACGGTCATTT-3'(SEQIDNO:2)。进一步的，所述产品为试剂盒或芯片。抑制HES2表达的试剂在制备治疗或辅助治疗食管鳞癌产品中的应用。进一步的，所述抑制HES2表达的试剂选自沉默HES2表达的siRNA、沉默HES2表达的shRNA、沉默HES2表达的反义寡核苷酸链中的至少一种。进一步的，所述沉默HES2表达的siRNA或者shRNA的靶向序列选自以下至少一种：5'-CTGGAGCACCTGTGGCGGAG-3'(SEQIDNO：5)；5'-GCCTTGCGACAGCTACCGCG-3'(SEQIDNO：6)。进一步的，所述沉默HES2表达的反义寡核苷酸链选自以下至少一种：HES2-AON#1：5'-GCTCACTAGTCCACTA-3'(SEQIDNO：7)；HES2-AON#2：5'-GCTGGTTAGATCTTAC-3'(SEQIDNO：8)；HES2-AON#3：5'-GTGAAATTGATGCTCG-3'(SEQIDNO：9)；HES2-AON#5：5'-TCCAGAGTCAAGCAAG-3'(SEQIDNO：11)。进一步的，所述产品为药剂或保健品。本专利技术的有益效果是：专利技术人通过利用多个食管癌及正常食管组织的mRNA表达谱芯片进行整合分析，发现HES2基因高表达于食管鳞癌组织。进一步的实验发现HES2基因的mRNA在食管鳞癌细胞系Eca109、EC9706、HKESC1、Kyse410、Kyse520中高表达，而其他食管癌细胞系相对表达较低。专利技术人进一步设计并合成能检测HES2基因RNA表达水平的荧光定量PCR引物及探针序列用于食管鳞癌的诊断；还设计并制定了免疫标记食管鳞癌中HES2蛋白的评分标准，通过免疫组织化学的方法，识别并预测食管鳞癌的恶性程度及发展趋势。专利技术人还设计针对HES2基因的反义寡核苷酸链(AON)序列，并针对AON序列中脱氧核酸进行硫代磷酸修饰设计，通过化学合成得到针对HES2的一条AON序列(HES2-AON#3)。本专利技术提供的免疫标记HES2蛋白的评分标准和针对HES2的一条AON序列可用于食管癌的预后判断和治疗。附图说明图1、HES2基因mRNA高表达于食管鳞癌组织。(A)临床组织样品的芯片数据中，肿瘤组织的HES2基因RNA水平高于正常食管组织；(B)在配对的癌组织与癌旁组织中检测HES2的表达情况。定量PCR结果显示，HES2在食管鳞癌中的表达水平相比配对的癌旁组织，其上调的倍数要比食管腺癌上调的倍数改变更加明显；(C)相对于非恶性的食管上皮细胞(NEEC-1、NEEC-2)，HES2基因在多个食管鳞癌细胞系中高表达；图中ESCC表示食管鳞癌，EAC表示食管腺癌。图2、HES2基因蛋白高表达于食管癌组织并与差的预后相关。(A)相对于食管腺癌(41.31％)，HES2染色中-强度在食管鳞癌(87.62％)中比例明显升高；(B)按我们拟定的免疫组化评分标准(SI评分)把HES2在食管鳞癌中的表达水平分成2组，0-4分为低表达组(HES2-L)，6-12分为高表达组(HES2-H)；(C)HES2基因的高表达预示着更短的总体生存时间和无病生存时间。图3、利用小发夹RNA稳定沉默HES2能抑制食管癌的恶性表型。(A、B)沉默HES2(shHes2#1、shHes2#2)能显著抑制食管鳞癌细胞的增殖能力；(C)沉默HES2(shHes2#1、shHes2#2)能抑制食管鳞癌细胞的迁移能力；(D)沉默HES2(shHes2#1、shHes2#2)能抑制食管癌细胞的侵袭能力。图4、利用靶向HES2的AON能抑制食管癌的恶性表型。(A、B)实时荧光定量分析和免疫印迹实验，确认该段AON能有效沉默食管鳞癌细胞中HES2的表达；(C)对小鼠分别皮下注射对照组细胞(Eca109)和沉默HES2的细胞(Eca109HES2-AON#3)，结果表明：沉默HES2能抑制食管鳞癌细胞的体内形成肿瘤的大小；(D)对小鼠分别尾静脉注射对照组细胞(Eca109Vector)和沉默HES2的细胞(Eca109HES2-AON#3)，结果表明：沉默HES2能抑制食管鳞癌细胞的肺转移能力。具体实施方式定量检测HES2本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.定量检测HES2的试剂在制备食管鳞癌辅助诊断或/和预后诊断产品中的应用。

【技术特征摘要】
1.定量检测HES2的试剂在制备食管鳞癌辅助诊断或/和预后诊断产品中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述定量检测HES2的试剂选自定量检测HES2的RNA转录水平的试剂、定量检测HES2的蛋白表达水平的试剂中的至少一种。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述定量检测HES2的RNA转录水平的试剂选自定量检测HES2的引物或探针。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述定量检测HES2的引物为：上游引物：5'-AACCAGAGCCTGAGCCAGCTTA-3'(SEQIDNO:1)；下游引物：5'-TGCAGGAAGCGCACGGTCATTT-3'(SEQIDNO:2)。5.根据权利要求1～4任一项所述的应用，其特征在于，所述产品为试剂盒或芯片。6.抑制HES2表达的试剂在制备治疗或辅助治疗食管鳞癌产品中的应用。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述抑制HES2表达的试剂选自沉默HES2表达的siRNA、沉默HES2...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋立兵，李隽，林楚勇，叶丽平，李悦，
申请(专利权)人：中山大学肿瘤防治中心中山大学附属肿瘤医院，中山大学肿瘤研究所，广州杰尔克生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44