一种从猪肝中结晶葡萄糖氧化酶的方法技术

本发明专利技术公开了一种从猪肝中结晶葡萄糖氧化酶的方法，涉及葡萄糖氧化酶技术领域。本发明专利技术包括猪肝经过打碎取浆、浸泡取液、甲壳素溶液絮凝沉淀、水浴锅水浴加温、板框过滤、低温浓缩、缓缓加入硫酸铵固体形成高浓度硫酸铵溶液进行脱盐提纯以及低温蒸发结晶处理。本发明专利技术通过从猪肝中获取葡萄糖氧化酶结晶，其中向浓缩液中缓缓加入硫酸铵固体形成90％的硫酸铵溶液再通过Tris‑HCl缓冲溶液获取脱盐浓缩液，为获取葡萄糖氧化酶结晶的获取提供保障，通过该方法生产的葡萄糖氧化酶GOD抗逆性好，酶活Ph区间大，能过动物的胃肠道，作用温度范围区间大，耐高温。

【技术实现步骤摘要】
一种从猪肝中结晶葡萄糖氧化酶的方法
本专利技术属于葡萄糖氧化酶结晶
，特别是涉及一种从猪肝中结晶葡萄糖氧化酶的方法。
技术介绍
葡萄糖氧化酶是从特异青霉(Penicilliumnotatum)等霉菌和蜂蜜中发现的酶。它能催化D-葡萄糖+O2D-葡糖酸(的δ-内酯)+H2O2的反应。EC1.1.3.4.特异青霉(P.notatum)的酶以其显有抗菌性而引入注意。因此，也有葡糖氧化酶(notatin)的称呼，现已清楚，抗菌性是由于反应生成的H2O2具灭菌作用。提纯物含有2分子的FAD，作为电子受体，除O2外，也能与2，6，二氯酚、靛酚反应。该酶对葡萄糖具有特异性。米氏常数Km也低(10-3M程度)，由于能定量地生成H2O2，因此作为D-葡萄糖的定量试剂而广泛被应用于生物化学领域和临床检查。葡萄糖氧化酶为诊断用酶，血浆中葡萄糖测定。用于生化研究，临床上常用作诊断酶，用于葡萄糖的分析，制备尿糖和血糖试纸，制药工业中用做维生素C及B12制剂的稳定剂，也可用于蛋白质的脱糖、罐头酒类的储藏。现有葡萄糖氧化酶提取方法微生物发酵法产生的葡萄糖氧化酶(GOD)；但这种方法获取的葡萄糖氧化酶的酶活低同时产生大量杂蛋白，分离提纯复杂、成本高；酶活Ph区间窄，不耐高温。猪肝脏中GOD含量丰富，资源也丰富。微生物发酵产生的GOD在85度水浴锅中5分钟检测活性存留20％，通过结晶生产的GOD在85度水浴锅中5分钟检测酶活存留60％。这样的活力存留在动物饲料中使用范围广。本专利技术致力于研发一种从猪肝中结晶葡萄糖氧化酶的方法，用于解决现有的采用微生物发酵法获取葡萄糖氧化酶过程复杂、成本高、抗逆性差、酶活PH区间窄以及不耐高温的问题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种从猪肝中结晶葡萄糖氧化酶的方法，通过对猪肝经过打碎取浆、絮凝沉淀、水浴加温、板框过滤、低温浓缩、脱盐提纯以及低温蒸发结晶处理获取葡萄糖氧化酶结晶，实现了从猪肝中获取葡萄糖氧化酶结晶，解决了现有的采用微生物发酵法获取葡萄糖氧化酶过程复杂、成本高、抗逆性差、酶活PH区间窄以及不耐高温的问题。为解决上述技术问题，本专利技术是通过以下技术方案实现的：本专利技术为一种从猪肝中结晶葡萄糖氧化酶的方法，包括如下过程：步骤一：打碎取浆：称取猪肝并切成块状用绞肉机打碎获取猪肝浆液；步骤二：浸泡取液：将所述猪肝浆液倒入搅拌筒内，加入相当于猪肝浆液3-5倍质量的水，经浸泡、搅拌、去漂浮物、取清液、离心分离、滤渣处理后获取浸泡液；步骤三：絮凝沉淀：调节浸泡液的PH值为6.0-7.0，向浸泡液中加入占浸泡液体积0.5％的质量分数为1％的甲壳素溶液，在60-80rpm絮凝沉淀2-3小时，经离心分离、去渣获取絮凝滤液；步骤四：水浴加温：将所述絮凝滤液在恒温水浴锅内加热至50-55℃，并保温10-20分钟后经冷水冷却；步骤五：板框过滤：在0.3Mpa下用硅藻土助滤对絮凝滤液进行板框过滤得到清酶液；步骤六：低温浓缩：在清酶液中添加占清酶液体积0.5％的质量分数为35％的甲醛溶液进行灭菌处理，在低温蒸发腔中保持温度0-10℃低温蒸发浓缩获取浓缩液；步骤七：脱盐提纯：在0-5℃温度下，向浓缩液中缓缓加入硫酸铵固体颗粒，直至形成90％的硫酸铵溶液，盐析5-8小时，经12000r/min离心获取沉淀，用PH为7.0的Tris-HCl缓冲溶液获取沉淀蛋白，加取水离子稀释6-8倍获取脱盐浓缩液；步骤八：蒸发结晶：在-20-30℃下冷冻蒸发72小时获取葡萄糖氧化酶结晶。优选地，所述步骤二中经浸泡、搅拌、去漂浮物、取清液、离心、滤渣处理后获取浸泡液的具体过程如下：所述浸泡时间为5-8小时，浸泡过程中每隔30分钟搅拌5分钟；所述去漂浮物依次包括循环操作滤除漂浮物、搅拌5分钟、静置20分钟直至静置后上层无漂浮物。优选地，所述絮凝沉淀中调节浸泡液的PH值为6.0-7.0具体过程为向浸泡液中加质量分数为0.5％的氢氧化钠溶液。优选地，所述板框过滤获取的清酶液进行除臭处理过程如下：对所述清酶液中用截留分子量为60000-80000的中空纤维超滤膜取出小分子蛋白；向所述清酶液中加入质量分数为8％的氯化钠溶液沉淀澄清，静置后获取除臭后清酶液。本专利技术具有以下有益效果：本专利技术通过对猪肝经过打碎取浆、絮凝沉淀、水浴加温、板框过滤、低温浓缩、脱盐提纯以及低温蒸发结晶处理获取葡萄糖氧化酶结晶，实现了从猪肝中获取葡萄糖氧化酶结晶，其中通过向浓缩液中缓缓加入硫酸铵固体形成90％的硫酸铵溶液再通过Tris-HCl缓冲溶液获取脱盐浓缩液，为获取葡萄糖氧化酶结晶的获取提供保障，通过该方法生产的葡萄糖氧化酶GOD抗逆性好，酶活Ph区间大，能过动物的胃肠道，作用温度范围区间大，耐高温。当然，实施本专利技术的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例的技术方案，下面将对实施例描述所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为本专利技术一种从猪肝中结晶葡萄糖氧化酶的方法的流程图。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本专利技术保护的范围。在本专利技术的描述中，需要理解的是，本专利技术中的相关术语，仅是为了便于描述本专利技术和简化描述，而不是指示或暗示所指的组件或元件必须具有特定的方位，以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本专利技术的限制。具体实施例一：保持PH为中性情况下获取猪肝清酶液：步骤一：打碎取浆：称取猪肝并切成块状用绞肉机打碎获取猪肝浆液；步骤二：浸泡取液：将猪肝浆液倒入搅拌筒内，加入相当于猪肝浆液5倍质量的水，经浸泡、搅拌、去漂浮物、取清液、离心分离、滤渣处理后获取浸泡液；浸泡时间为8小时，浸泡过程中每隔30分钟搅拌5分钟；去漂浮物依次包括循环操作滤除漂浮物、搅拌5分钟、静置20分钟直至静置后上层无漂浮物；步骤三：絮凝沉淀：通过向浸泡液中加质量分数为0.5％的氢氧化钠溶液调节浸泡液的PH值为7.0，向浸泡液中加入占浸泡液体积0.5％的质量分数为1％的甲壳素溶液，在80rpm絮凝沉淀3小时，经离心分离、去渣获取絮凝滤液；步骤四：水浴加温：将絮凝滤液在恒温水浴锅内加热至55℃，并保温20分钟后经冷水冷却；步骤五：板框过滤：在0.3Mpa下用硅藻土助滤对絮凝滤液进行板框过滤得到清酶液；对清酶液中用截留分子量为60000-80000的中空纤维超滤膜取出小分子蛋白；向清酶液中加入质量分数为8％的氯化钠溶液沉淀澄清，静置后获取除臭后清酶液；步骤六：低温浓缩：在清酶液中添加占清酶液体积0.5％的质量分数为35％的甲醛溶液进行灭菌处理，在低温蒸发腔中保持温度5℃低温蒸发浓缩获取浓缩液；步骤七：脱盐提纯：在5℃温度下，向浓缩液中缓缓加入硫酸铵固体颗粒，直至形成90％的硫酸铵溶液，盐析8小时，经12000r/min离心获取沉淀，用PH为7.0的Tris-HCl缓冲溶液获取沉淀蛋白，加取水离子稀释8倍获取脱本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种从猪肝中结晶葡萄糖氧化酶的方法，其特征在于：包括如下过程：步骤一：打碎取浆：称取猪肝并切成块状用绞肉机打碎获取猪肝浆液；步骤二：浸泡取液：将所述猪肝浆液倒入搅拌筒内，加入相当于猪肝浆液3‑5倍质量的水，经浸泡、搅拌、去漂浮物、取清液、离心分离、滤渣处理后获取浸泡液；步骤三：絮凝沉淀：调节浸泡液的PH值为6.0‑7.0，向浸泡液中加入占浸泡液体积0.5％的质量分数为1％的甲壳素溶液，在60‑80rpm絮凝沉淀2‑3小时，经离心分离、去渣获取絮凝滤液；步骤四：水浴加温：将所述絮凝滤液在恒温水浴锅内加热至50‑55℃，并保温10‑20分钟后经冷水冷却；步骤五：板框过滤：在0.3Mpa下用硅藻土助滤对絮凝滤液进行板框过滤得到清酶液；步骤六：低温浓缩：在清酶液中添加占清酶液体积0.5％的质量分数为35％的甲醛溶液进行灭菌处理，在低温蒸发腔中保持温度0‑10℃低温蒸发浓缩获取浓缩液；步骤七：脱盐提纯：在0‑5℃温度下，向浓缩液中缓缓加入硫酸铵固体颗粒，直至形成90％的硫酸铵溶液，盐析5‑8小时，经12000r/min离心获取沉淀，用PH为7.0的Tris‑HCl缓冲溶液获取沉淀蛋白，加取水离子稀释6‑8倍获取脱盐浓缩液；步骤八：蒸发结晶：在‑20‑30℃下冷冻蒸发72小时获取葡萄糖氧化酶结晶。...

【技术特征摘要】
1.一种从猪肝中结晶葡萄糖氧化酶的方法，其特征在于：包括如下过程：步骤一：打碎取浆：称取猪肝并切成块状用绞肉机打碎获取猪肝浆液；步骤二：浸泡取液：将所述猪肝浆液倒入搅拌筒内，加入相当于猪肝浆液3-5倍质量的水，经浸泡、搅拌、去漂浮物、取清液、离心分离、滤渣处理后获取浸泡液；步骤三：絮凝沉淀：调节浸泡液的PH值为6.0-7.0，向浸泡液中加入占浸泡液体积0.5％的质量分数为1％的甲壳素溶液，在60-80rpm絮凝沉淀2-3小时，经离心分离、去渣获取絮凝滤液；步骤四：水浴加温：将所述絮凝滤液在恒温水浴锅内加热至50-55℃，并保温10-20分钟后经冷水冷却；步骤五：板框过滤：在0.3Mpa下用硅藻土助滤对絮凝滤液进行板框过滤得到清酶液；步骤六：低温浓缩：在清酶液中添加占清酶液体积0.5％的质量分数为35％的甲醛溶液进行灭菌处理，在低温蒸发腔中保持温度0-10℃低温蒸发浓缩获取浓缩液；步骤七：脱盐提纯：在0-5℃温度下，向浓缩液中缓缓加入硫酸铵固体颗粒，直至形成90％的硫酸铵溶液，盐析5-8小时，经12000r/min离心获...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐双贵，胡培，李垒，
申请(专利权)人：安徽省新康饲料有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽,34