一种异柠檬酸脱氢酶3(NAD制造技术

本发明专利技术涉及一种异柠檬酸脱氢酶3(NAD

【技术实现步骤摘要】
一种异柠檬酸脱氢酶3(NAD+)γ突变蛋白及应用
本专利技术涉及一种基因工程领域，尤其涉及一种异柠檬酸脱氢酶3(NAD+)γ突变蛋白及应用。
技术介绍
异柠檬酸脱氢酶(isocitratedehydrogenase,IDH)是三羧酸循环过程中一种关键的限速酶，参与生物体的一系列生命活动。人的异柠檬酸脱氢酶发生突变会对人类健康造成严重影响。在对肝脏疾病，如肝硬化、肝癌等患者的外周血进行基因测序的过程中，均发现患者的异柠檬酸脱氢酶3(NAD+)γ(Isocitratedehydrogenase3(NAD+)gamma)发生了突变，因此，对人的异柠檬酸脱氢酶3(NAD+)γ突变的检测对判断人体是否患有肝脏疾病具有一定的指引作用。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种人的异柠檬酸脱氢酶3(NAD+)γ突变蛋白及应用。本专利技术技术方案包括：第一方面，提供一种人的异柠檬酸脱氢酶3(NAD+)γ突变蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。第二方面，提供一种人的异柠檬酸脱氢酶3(NAD+)γ突变蛋白的编码基因，其核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。第三方面，提供一种基因芯片，包括：固相载体和固定在该载体上的核苷酸探针；所述核苷酸探针根据上述所述人的异柠檬酸脱氢酶3(NAD+)γ突变蛋白的核苷酸序列，与人的异柠檬酸脱氢酶3(NAD+)γ正常蛋白的核苷酸序列的比对结果确定。优选地，所述核苷酸探针为SEQIDNO:3所示的碱基序列；或，所述核苷酸探针为SEQIDNO:4所示的碱基序列。第四方面，提供一种特异性识别人的异柠檬酸脱氢酶3(NAD+)γ突变蛋白的单克隆抗体，其可与SEQIDNO:1所示的氨基酸序列特异性结合。第五方面，提供一种用于检测人的异柠檬酸脱氢酶3(NAD+)γ突变蛋白的抗体的ELISA试剂盒，所述ELISA试剂盒包括：包被有上述单克隆抗体的ELISA酶标板、酶标二抗、检测对象的异柠檬酸脱氢酶3(NAD+)γ蛋白、样品稀释液、包被缓冲液、ELISA酶标板洗涤液、显色液和终止液。优选地，所述酶标二抗为稀释的HRP辣根过氧化物酶标记的山羊抗人IgG。本专利技术提供了一种异柠檬酸脱氢酶3(NAD+)γ突变蛋白及应用，将大量癌症患者作为研究病例，对病例进行基因检测并分析，确定出人的异柠檬酸脱氢酶3(NAD+)γ的突变蛋白，根据该人的异柠檬酸脱氢酶3(NAD+)γ突变蛋白制备基因芯片、单克隆抗体和ELISA试剂盒，为肝硬化、肝癌的基因诊断提供指引作用，为癌症的诊断和治疗提供一定的理论基础。上述说明仅是本专利技术技术方案的概述，为了能够更清楚了解本专利技术的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本专利技术的较佳实施例并配合附图详细说明如后。附图说明图1是本专利技术实施例一提供的一种比对结果示意图；图2是本专利技术实施例一提供的一种基因芯片布局图；图3是本专利技术实施例二提供的一种显色结果示意图；图4是本专利技术实施例二提供的另一种显色结果示意图；图5是本专利技术实施例五提供的为蛋白含量的标准曲线；图6是本专利技术实施例五提供的Westernblot检测结果示意图；图7是本专利技术实施例六提供的为蛋白含量的标准曲线；图8是本专利技术实施例六提供的Westernblot检测结果示意图。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例一、基因芯片的制备首先，可以根据申请号为“201710429915.8”、专利名称为“一种突变蛋白的检测方法及装置”的中国专利技术专利中描述的检测方法，确定出人的异柠檬酸脱氢酶3(NAD+)γ突变蛋白的编码基因，其核苷酸序列如SEQIDNO:2所示；相应地，根据该编码基因确定出人的异柠檬酸脱氢酶3(NAD+)γ突变蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。其次，根据人的异柠檬酸脱氢酶3(NAD+)γ突变蛋白及其编码基因，按照如下方式实现基因芯片的制备。1、核苷酸探针的设计(1)核苷酸探针的设计：核苷酸探针根据人的异柠檬酸脱氢酶3(NAD+)γ突变蛋白的核苷酸序列，与人的异柠檬酸脱氢酶3(NAD+)γ正常蛋白的核苷酸序列的比对结果来确定，并根据如下探针的设计原则，设计出针对人的异柠檬酸脱氢酶3(NAD+)γ突变蛋白的特异性的核苷酸探针。其中，核苷酸探针设计的原则如下：①核苷酸探针Tm值应接近整个基因组的平均Tm值，上下波动5℃；②核苷酸探针分子内重复的单一碱基连续不超过4个；③G+C含量为40％-60％，减少非特异性杂交保证杂交的特异性；④核苷酸探针序列中与探针分子内部稳定二级结构配对的碱基长度应少于4bp，这样可以保证不会因核苷酸探针内部稳定的二级结构而影响杂交效率；⑤经同源比较与其他序列的相似性小于40％；⑥经对比与非探针备选序列的同源片段连续不超过20个碱基。其中，人的异柠檬酸脱氢酶3(NAD+)γ突变蛋白对应的氨基酸序列与人的异柠檬酸脱氢酶3(NAD+)γ正常蛋白对应的氨基酸序列的比对结果请参考图1，其中，图1中的Query序列是人的异柠檬酸脱氢酶3(NAD+)γ突变蛋白对应的氨基酸序列，Sbjct序列是人的异柠檬酸脱氢酶3(NAD+)γ正常蛋白对应的氨基酸序列，Query序列与Sbjct序列之间的序列为比对结果，根据图1可知，人的异柠檬酸脱氢酶3(NAD+)γ突变蛋白相对于人的异柠檬酸脱氢酶3(NAD+)γ正常蛋白，有一处氨基酸序列存在缺失。根据SEQIDNO:2所示的核苷酸序列，以及图1的比对结果，为了能够特异性识别待检测对象的异柠檬酸脱氢酶3(NAD+)γ是否发生了突变，那么在选取核苷酸探针时，可以在缺失位置之前与缺失位置之后各选择若干个核苷酸序列(碱基顺序不变)，生成核苷酸探针。在本实施例中，根据SEQIDNO:2所示的核苷酸序列以及根据上述核苷酸探针设计原则，按照上述方式至少可以设计出如下几种优选地核苷酸探针：如SEQIDNO:3所示的核苷酸探针为：atgcaggctacga；如SEQIDNO:4所示的核苷酸探针为：catgcaggct。(2)核苷酸探针的合成：通过核苷酸序列合成上述设计好的核苷酸探针。2、检测人的异柠檬酸脱氢酶3(NAD+)γ是否发生突变的基因芯片的制备为了保证检测对象样品的质量，还需在基因芯片上设计空白对照、阳性对照和阴性对照。其中，该基因芯片的布局至少可以为如图2所示的一种布局。在图2中，□为空白对照，○为阴性对照，为阳性对照，为实验组。其中，实验组的位置即为核苷酸探针的点样位置。对于空白对照、阴性对照所需点样的阴性内参质控探针、以及阳性对照所需点样的阳性内参质控探针设计如下：空白对照：是不含任何基因片段的空白点样液作为芯片制备过程中的污染监控指标。阴性内参质控探针：是一段与检测基因没有同源性的其他基因片段，作为杂交过程中非特异性杂交的监控指标，阴性内参质控探针包括的核苷酸个数可以与核苷酸探针的碱基个数相同，也可以不同。本专利技术实施例中，基因芯片所需的阴性内参探针序列可以为：tgatgctgataattgcat。阳性内参质控探针：是一段与检测基因有同源性的其他基因片段，在人的异柠檬酸脱氢酶3(NAD+)γ突变蛋白中，选择与核苷酸探针对应的序列不同，且可以与核苷酸探针碱基的个数相同，也可以与核苷酸探针碱基本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种人的异柠檬酸脱氢酶3(NAD+)γ的突变蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

【技术特征摘要】
1.一种人的异柠檬酸脱氢酶3(NAD+)γ的突变蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。2.一种人的异柠檬酸脱氢酶3(NAD+)γ突变蛋白的编码基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。3.一种基因芯片，其特征在于，包括：固相载体和固定在该载体上的核苷酸探针；所述核苷酸探针根据权利要求2所述人的异柠檬酸脱氢酶3(NAD+)γ突变蛋白的核苷酸序列，与人的异柠檬酸脱氢酶3(NAD+)γ正常蛋白的核苷酸序列的比对结果确定。4.根据权利要求3所述的基因芯片，其特征在于，所述核苷酸探针为SEQIDNO:3所示的碱基序列；或，所述核苷酸探针为SEQIDNO:4所示的碱基序列。...

【专利技术属性】
技术研发人员：张耀洲，吴玉乾，冯建华，李冬梅，张树军，陈玉皎，王文雅，
申请(专利权)人：天津市湖滨盘古基因科学发展有限公司，
类型：发明
国别省市：天津,12