硝基还原酶基因lnr及其编码的蛋白和应用制造技术

本发明专利技术公开了硝基还原酶基因lnr及其编码的蛋白和应用。一种硝基还原酶基因lnr，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1，全长为609bp，编码202个氨基酸，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2。LNR能催化还原二甲戊灵苯环C‑6位上的硝基基团生成2‑硝基‑6‑氨基‑N‑(1‑乙基丙基)‑3,4‑二甲苯胺，也能催化还原仲丁灵、氨磺灵和氟乐灵苯环上两个对称的硝基基团，但它的催化效率明显高于PNR。LNR具有更广谱的底物谱，在消除硝基芳烃除草剂残留引起的环境污染修复方面具有更广阔的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
硝基还原酶基因lnr及其编码的蛋白和应用
本专利技术属于环境微生物和农业领域，涉及降解二甲戊灵、仲丁灵、氨磺灵和氟乐灵的硝基还原酶基因lnr及其编码的蛋白和应用。
技术介绍
随着对粮食产量要求的提高，在世界范围内的化学除草面积也逐渐扩大，除草剂的施用量也居高不下。除草剂的使用可减轻农业劳动强度、保证农业正常生产甚至高产，但是长期以来大量除草剂的使用也不可避免地产生了负面影响：土壤、地下水和空气中的农药污染；在某些作物中残留；对人体健康的潜在危害。大量研究表明微生物降解是农药在环境中消失的最主要因素，且微生物降解修复技术是一种原位生物修复技术，效果好，费用低，无二次污染，适合大面积污染修复，是土壤有机污染物修复技术的主流和发展方向。二硝基苯胺类除草剂是一类优秀的旱田作物选择性除草剂,在化学除草中占有重要地位，主要品种包括二甲戊灵、仲丁灵、氨磺灵和氟乐灵。它们具有广谱的除草活性，应用范围广、用量大，在土壤中具有中度持久性，半衰期为2-3个月。据相关资料显示，在美国近几年的大豆除草剂施用种类调查中，二甲戊灵和氟乐灵的使用量仅次于草甘膦。现已发现该类除草剂的残留对生态环境、水生生物及人体健康都有潜在危害。目前，国内外已筛选到很多能降解二甲戊灵、仲丁灵、氨磺灵和氟乐灵的细菌和真菌菌株，并利用HPLC、GC和MS等方法鉴定了降解中间产物，并根据中间产物的鉴定推测了微生物降解的部分代谢途径。研究表明微生物降解二硝基苯胺类除草剂的主要方式有氧化N端脱烷基和硝基还原作用，但至今微生物降解二硝基苯胺类除草剂的全过程还不清楚，且参与其中的降解基因/酶还鲜有报道。BacillussubtilisY3是一株二甲戊灵高效降解菌株，采用HPLC-MS/MS鉴定了菌株Y3降解二甲戊灵生成的中间产物为2-硝基-6-氨基-N-(1-乙基丙基)-3,4-二甲苯胺(6-氨基二甲戊灵)。对菌株Y3基因组框架图进行分析发现，菌株Y3中有很多nitroreductases-like的orfs，因此不采用异源表达的方法分别对各个基因进行功能鉴定，转而通过菌株粗酶液蛋白纯化的方法获得了二甲戊灵硝基还原酶PNR。PNR是首个报道的二甲戊灵硝基还原酶，同时它还能催化还原仲丁灵、氨磺灵和氟乐灵的两个硝基基团。获得二甲戊灵、仲丁灵、氨磺灵和氟乐灵降解代谢菌株和降解基因/酶在治理其残留，消除其药害中具有以下作用：(1)通过现代生物技术将降解基因导入作物构建相应的除草剂抗性转基因作物；(2)通过现代微生物发酵技术将降解菌株和基因制成降解菌剂或酶制剂实现土壤原位修复。终上所述，二甲戊灵、仲丁灵、氨磺灵和氟乐灵的降解基因/酶在消除该类除草剂药害及生物转化领域中具有非常重要的理论和应用价值。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有研究的不足，提供一种降解二甲戊灵、仲丁灵、氨磺灵和氟乐灵硝基还原酶基因。本专利技术的另一目的是提供该基因编码的蛋白。本专利技术的又一目的是提供该基因的应用。一种硝基还原酶基因lnr，核苷酸序列为SEQIDNO.1。本专利技术所述的硝基还原酶基因lnr编码的硝基还原酶LNR，氨基酸序列为：SEQIDNO.2。含有本专利技术所述的硝基还原酶基因lnr的重组表达载体。含有本专利技术所述的硝基还原酶基因lnr的基因工程菌。本专利技术所述硝基还原酶基因lnr在构建降解二甲戊灵、仲丁灵、氨磺灵和氟乐灵的转基因作物中的应用。本专利技术所述硝基还原酶基因lnr在降解二甲戊灵、仲丁灵、氨磺灵和氟乐灵中的应用。本专利技术所述硝基还原酶LNR在降解二甲戊灵、仲丁灵、氨磺灵和氟乐灵中的应用。本专利技术所述硝基还原酶LNR在去除土壤、水体中二甲戊灵、仲丁灵、氨磺灵和氟乐灵的应用。本专利技术所述的重组表达载体在降解二甲戊灵、仲丁灵、氨磺灵和氟乐灵中的应用。本专利技术所述的重组表达载体在构建降解二甲戊灵、仲丁灵、氨磺灵和氟乐灵的转基因作物中的应用。有益效果：本专利技术硝基还原酶基因lnr是继硝基还原酶基因pnr后再次公开的能降解二甲戊灵、仲丁灵、氨磺灵和氟乐灵的降解基因。本专利技术提供的硝基还原酶LNR能在10min内降解100mg/L的二甲戊灵、仲丁灵、氨磺灵或氟乐灵。与PNR相同，LNR能催化还原二甲戊灵苯环C-6位上的硝基基团，也能催化还原仲丁灵、氨磺灵和氟乐灵苯环上两个对称的硝基基团，但它的催化效率明显高于PNR。此外，LNR还能催化转化二苯醚类除草剂乙羧氟草醚，而PNR不能催化还原该除草剂，且LNR与PNR的蛋白氨基酸序列相似性仅为40％，这说明LNR是不同于PNR的又一新的催化效率更高的催化还原二甲戊灵、仲丁灵、氨磺灵和氟乐灵的硝基还原酶。因此，硝基还原酶基因lnr在构建降解二甲戊灵、仲丁灵、氨磺灵和氟乐灵转基因作物中有潜在应用价值，硝基还原酶蛋白LNR在降解二甲戊灵、仲丁灵、氨磺灵和氟乐灵中应用前景良好。且LNR具有更广谱的底物谱，在消除硝基芳烃除草剂残留引起的环境污染修复方面具有更广阔的应用前景。附图说明图1表达产物PNR的Native-PAGE凝胶电泳检测。箭头指处为透明条带的位置。图2蛋白质肽指纹图谱分析结果，下划线字体的肽段序列表示分析结果得到的肽段与LNR氨基酸序列的吻合部分。肽指纹图谱分析所得的肽段氨基酸序列在LNR氨基酸序列中的覆盖率为5％。图3LNR与催化功能已鉴定报道的硝基还原酶的蛋白氨基酸序列系统发育进化分析。图4Ni2+-NTAresin纯化异源表达蛋白LNR。1为蛋白电泳Marker，2为PNR，3为LNR。图5LNR催化还原二甲戊灵的产物UHPLC-MS鉴定。A，二甲戊灵的UHPLC-MS分析图谱，RT＝9.06min；B，LNR还原二甲戊灵的产物2-硝基-6-氨基-N-(1-乙基丙基)-3,4-二甲苯胺的UHPLC-MS分析图谱，RT＝8.50min。图6LNR催化还原仲丁灵的产物UHPLC-MS鉴定。A，仲丁灵的UHPLC-MS分析图谱，RT＝9.20min；B，LNR还原仲丁灵一个硝基基团的产物4-(1,1-二甲基乙基)-N-(1-甲基丙基)-6-硝基-1,2-苯二胺的UHPLC-MS分析图谱，RT＝8.84min；C，LNR还原仲丁灵两个硝基基团的产物4-(1,1-二甲基乙基)-N-(1-甲基丙基)-1,2,6-苯三胺的UHPLC-MS分析图谱，RT＝5.30min。图7LNR催化还原氨磺灵的产物UHPLC-MS鉴定。A，氨磺灵的UHPLC-MS分析图谱，RT＝7.95min；B，LNR还原氨磺灵一个硝基基团的产物3-硝基-5-氨基-N’,N’-二丙基磺胺的UHPLC-MS分析图谱，RT＝7.59min；C，LNR还原氨磺灵两个硝基基团的产物3,5-二氨基-N’,N’-二丙基磺胺的UHPLC-MS分析图谱，RT＝6.07min。图8LNR催化还原氟乐灵的产物UHPLC-MS鉴定。A，氟乐灵的UHPLC-MS分析图谱，RT＝9.16min；B，LNR还原氟乐灵一个硝基基团的产物α,α,α-三氟-2-氨基-6-硝基-N,N-二丙基对甲苯胺的UHPLC-MS分析图谱，RT＝9.05min；C，LNR还原氟乐灵两个硝基基团的产物α,α,α-三氟-2,6-二氨基-N,N-二丙基对甲苯胺的UHPLC-MS分析图谱，RT＝8.30min。图9硝基还原酶LNR催化还原二甲戊灵、仲丁灵、氨本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种硝基还原酶基因lnr，其特征核苷酸序列为SEQ ID NO.1。

【技术特征摘要】
1.一种硝基还原酶基因lnr，其特征核苷酸序列为SEQIDNO.1。2.权利要求1所述的硝基还原酶基因lnr编码的硝基还原酶LNR，其特征氨基酸序列为：SEQIDNO.2。3.含有权利要求1所述的硝基还原酶基因lnr的重组表达载体。4.含有权利要求1所述的硝基还原酶基因lnr的基因工程菌。5.权利要求1所述硝基还原酶基因lnr在构建降解二硝基苯胺类除草剂的转基因作物中的应用；所述的二硝基苯胺类除草剂包括二甲戊灵、仲丁灵、氨磺灵或氟乐灵。6.权利要求1所述硝基还原酶基因lnr在降解二硝基苯胺类除草剂中的应用；所述的二硝基苯胺类除草剂包括二甲戊灵、仲丁灵、氨磺灵或氟乐灵。7....

【专利技术属性】
技术研发人员：何健，倪海燕，李娜，贺芹，朱建春，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32