一种嵌合蛋白AQP4-CH2、制备及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种嵌合蛋白AQP4‑CH2、制备及其应用，属于生物医药工程技术领域。本发明专利技术首先利用蛋白质三维结构模拟，将AQP4的三段抗原表位(A环、C环和E环)取代人抗体恒定区CH2中不规则卷曲，使其展示在CH2蛋白表面；然后人工合成密码子优化的嵌合蛋白基因，利用分子克隆技术，构建原核表达载体；转化大肠杆菌筛选高效表达嵌合蛋白菌株，Ni‑亲和层析纯化嵌合蛋白AQP4‑CH2；以嵌合蛋白为抗原包被酶标版，采用酶联免疫分析(ELISA)法测定视神经脊髓炎患者的血清及脑脊液中的AQP4抗体，用于早期鉴别诊断视神经脊髓炎与多发性硬化。

【技术实现步骤摘要】
一种嵌合蛋白AQP4-CH2、制备及其应用
本专利技术属于生物医药工程
，具体地，涉及一种嵌合蛋白AQP4-CH2、制备及其应用。
技术介绍
视神经脊髓炎主要累及视神经与脊髓，是一种炎性脱髓鞘性疾病，其主要临床表现为亚急性发病的不同程度的视力障碍、双下肢瘫痪、感觉及二便障碍，由于其与多发性硬化在临床症状上具有相似性，临床上对两者是否为同一疾病的不同亚型存在广泛的争议。近年来随着视神经脊髓炎病例报道的增多以及相关研究的进展，视神经脊髓炎在临床经过、神经影像学、血清学、免疫病理学等方面均与多发性硬化表现不一致。视神经脊髓炎受累的脊髓节段比较长，长度在３个或３个以上椎体节段，称之为纵向扩展性横贯性脊髓炎，与之不同的是，多发性硬化的病灶以大脑半球为主，脊髓病灶很少超过２个椎体，且多位于脊髓周边。然而，由于视神经脊髓炎早期可出现脑部病灶，其与多发性硬化的预后有很大不同，因此，寻找能够帮助早期诊断、鉴别的生物学标志将有助于对患者的治疗。水通道蛋白4（AQP4）是一种糖蛋白，是分布于中枢神经系统的高选择性的水跨膜转运通道蛋白，相对分子质量约为30000，含有301个氨基酸。分子结构呈四聚体，其中每个单体都具有独立的转运水通道活性。其一级结构由5个环(A、B、C、D和E)连接6个跨膜区段构成，包括2个胞内环(B和D)和3个胞外环(A、C和E)，B和D环与羧基、氨基末端均在胞内，A、C和E环位于胞膜外侧，是AQP4的主要抗原表位。6个跨膜区包绕着B和E环形成一个桶状结构作为水分子通道。B和E环呈疏水性，其任何变化都会引起水通道活性的下降，其余环为亲水性。肽链的氨基端和羧基端由相似的重复序列构成，各自拥有天冬酰胺-脯氨酸-丙氨酸(Asn-Pro-Ala，NPA)特征性序列，该序列是AQP家族共有的特征性结构，对水的通透性具有决定性作用。氨基端和羧基端在结构上彼此呈180°中心对称排列，氨基酸序列经过约40%α螺旋和42%β片层及转角构成其二级结构，同源的四聚体再构成AQP4的三级结构。AQP4主要表达于脑膜表面、室管膜和脑室周围，其他在下丘脑视上核、小脑、海马齿状回、中缰核、脉络丛上皮、视网膜及视神经也可有表达，不同部位的AQP4发挥各自功能，共同参与脑脊液的分泌、分布与重吸收，此外，对于脑内渗透压、Ｋ+的平衡及脑水肿的病理机制起到重要调节作用。水通道蛋白4抗体（AQP4Ab）又称视神经脊髓炎特异性抗体，是Lennon等于2004年发现的。AQP4抗体能激活补体系统，引起中枢神经系统炎性脱髓鞘和坏死，诱导星型胶质细胞的损害。AQP4抗体存在与视神经脊髓炎患者的血清及脑脊液中，对于早期诊断鉴别视神经脊髓炎与多发性硬化具有重要意义。临床上对水通道蛋白４抗体的检测方法的研究较为广泛，目前的检测方法有细胞免疫共沉淀法、放射免疫共沉淀法、组织间接免疫荧光检测、细胞免疫荧光法及酶联免疫吸附测定法等，各种方法优缺点不同。
技术实现思路
针对上述情况，本专利技术的目的在于提供一种嵌合蛋白AQP4-CH2，该蛋白是在人抗体恒定区CH2表面展示AQP4抗原表位；目的二在于提供制备上述嵌合蛋白AQP4-CH2的方法；目的三进一步提供上述嵌合蛋白AQP4-CH2的应用，作为包被抗原用于AQP4抗体检测，可用于视神经脊髓炎与多发性硬化早期鉴别诊断。为了实现上述目的，本专利技术采用的具体方案为：一种嵌合蛋白AQP4-CH2，所述嵌合蛋白AQP4-CH2是在人抗体IgG1恒定区CH2蛋白表面展示AQP4抗原表位；所述AQP4抗原表位包括A环、C环和E环；所述A环、C环和E环分别替代CH2结构中的不规则卷曲段使得A环、C环和E环展示在人抗体IgG1恒定区CH2蛋白表面。进一步的，编码AQP4抗原表位A环的基因序列如SEQIDNO:1所示，氨基酸序列如SEQIDNO:2所示；编码AQP4抗原表位C环的基因序列如SEQIDNO:3所示，氨基酸序列如SEQIDNO:4所示；编码AQP4抗原表位E环的基因序列如SEQIDNO:5所示，氨基酸序列如SEQIDNO:6所示；编码人抗体IgG1恒定区CH2的基因序列如SEQIDNO:7所示，氨基酸序列如SEQIDNO:8所示。进一步的，所述嵌合蛋白AQP4-CH2的氨基酸序列如SEQIDNO:10所示。更进一步的，编码所述嵌合蛋白AQP4-CH2的基因序列如SEQIDNO:9所示。本专利技术还进一步保护制备上述嵌合蛋白AQP4-CH2的方法，首先构建含有SEQIDNO:9基因序列的原核表达载体，转化大肠杆菌细胞，表达嵌合蛋白AQP4-CH2，采用Ni-亲和层析分离纯化得到嵌合蛋白AQP4-CH2。本专利技术另外还保护上述嵌合蛋白AQP4-CH26在AQP4抗体检测中的应用，所述应用进一步是指嵌合蛋白AQP4-CH2作为包被抗原在视神经脊髓炎与多发性硬化早期鉴别和诊断中的应用。术语“嵌合蛋白”是指利用DNA重组技术得到的两个不同的基因组合后的表达产物，即嵌合基因的表达产物。有益效果：本专利技术的创新在于将AQP4抗原表位的三个肽段（A环、C环和E环）分别取代人抗体恒定区CH2蛋白中不规则卷曲结构中的氨基酸，使其展示在CH2蛋白表面，构建成嵌合蛋白AQP4-CH2。该嵌合蛋白具有以下几个优点：一、由于AQP4为多次跨膜糖蛋白，采用常规的原核表达不能得到有活性的蛋白质，采用真核表达系统虽然可以得到AQP4蛋白，但是，其产量低、成本高，不适用大规模生产使用，本专利技术将AQP4的三个抗原表位嵌合至人抗体CH2蛋白，使其使用原核表达系统大量表达成为可能；二、选用人抗体CH2作为支架蛋白，可以避免检测过程中支架蛋白与人抗体之间发生交叉反应而产生假阳性；三、该嵌合蛋白不仅能够同时展示AQP4的三个独立抗原表位，并且能够模拟AQP4抗原表位的空间位置，提高与AQP4抗体的结合能力。本专利技术所述AQP4-CH2嵌合蛋白，使AQP4抗原表位展示在CH2蛋白表面，以便与AQP4抗体结合，作为ELISA法检测AQP4抗体的包被抗原，用于视神经脊髓炎与多发性硬化早期诊断鉴别诊断。附图说明图1是人抗体恒定区CH2和嵌合蛋白AQP4-CH2氨基酸序列对比图；其中，图中下划线部分为AQP4抗原表位A环、C环和E环替代CH2中氨基酸的替换部位；图2是嵌合蛋白AQP4-CH2三维结构模拟结构图，其中，绿色部分（Ⅰ部分）为支架蛋白CH2，黄色部分（Ⅱ部分）为AQP4抗原表位A环，红色部分（Ⅲ部分）为AQP4抗原表位C环，蓝色部分（Ⅳ部分）为AQP4抗原表位E环；图3是AQP4抗原表位在嵌合蛋白AQP4-CH2表面展示示意图；图4是琼脂糖凝胶电泳检测载体pET-22b（+）-AQP4-CH2和PCR鉴定重组载体pET-22b（+）-AQP4-CH2的电泳图；图中，M：DNA分子量标准（bp）；1：质粒载体pET-22b（+）-AQP4-CH2；2：PCR扩增产物；图5是SDS-PAGE检测嵌合蛋白表达电泳图；图中，M：蛋白质分子量标准（kDa）；0：添加诱导剂前细菌阴性对照；2-4：分别表示加入诱导剂2、3、4小时后表达嵌合蛋白的细菌样品；图6是SDS-PAGE鉴定Ni-亲和层析纯化嵌合蛋白电泳图；图中，M：蛋白质分子量标准（kDa）；1：细菌阴性对照；2：诱导表达嵌合本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种嵌合蛋白AQP4‑CH2，其特征在于：所述嵌合蛋白AQP4‑CH2是在人抗体IgG1恒定区CH2蛋白表面展示AQP4抗原表位；所述AQP4抗原表位包括A环、C环和E环；所述A环、C环和E环分别替代CH2结构中的不规则卷曲段使得A环、C环和E环展示在人抗体IgG1恒定区CH2蛋白表面。

【技术特征摘要】
1.一种嵌合蛋白AQP4-CH2，其特征在于：所述嵌合蛋白AQP4-CH2是在人抗体IgG1恒定区CH2蛋白表面展示AQP4抗原表位；所述AQP4抗原表位包括A环、C环和E环；所述A环、C环和E环分别替代CH2结构中的不规则卷曲段使得A环、C环和E环展示在人抗体IgG1恒定区CH2蛋白表面。2.如权利要求1所述的一种嵌合蛋白AQP4-CH2，其特征在于：编码AQP4抗原表位A环的基因序列如SEQIDNO:1所示，氨基酸序列如SEQIDNO:2所示；编码AQP4抗原表位C环的基因序列如SEQIDNO:3所示，氨基酸序列如SEQIDNO:4所示；编码AQP4抗原表位E环的基因序列如SEQIDNO:5所示，氨基酸序列如SEQIDNO:6所示；编码人抗体IgG1恒定区CH2的基因序列如SEQIDNO:7所示，氨基酸序列如SEQI...

【专利技术属性】
技术研发人员：祖向阳，胡志刚，杜喆，张晓兰，黄磊，付东辽，薛云，高伟娜，马晓孟，宋春辉，
申请(专利权)人：河南科技大学，
类型：发明
国别省市：河南,41