本发明专利技术提供了一种检测肠致病性大肠杆菌的核酸适配体电化学传感器，包括通过S‑Au键连接于金电极表面的捕获探针，以及与捕获探针杂交形成双链的信号探针；本发明专利技术还提供了所述传感器的制备方法以及其应用。采用本发明专利技术实施例提供的核酸适配体电化学传感器，可以用于肠致病性大肠杆菌的检测，采用该传感器检测肠致病性大肠杆菌，与现有检测方法相比，用时较少且操作更加便捷。
【技术实现步骤摘要】
一种检测肠致病性大肠杆菌的核酸适配体电化学传感器及其制备方法和应用
本专利技术涉及电化学传感器
，特别是涉及一种检测肠致病性大肠杆菌的核酸适配体的电化学传感器、以及其制备方法和应用。
技术介绍
肠致病性大肠杆菌是众多病原微生物中存在最为广泛且危险系数高的细菌之一，对人和动物均有病原性，可引起腹痛、腹泻、炎症、溃疡等病症，严重者还会引起出血性肠炎、溶血性尿毒综合征等，对于婴幼儿尤其危险。所以，对肠致病性大肠杆菌的定量检测一直是环境卫生学领域中重要的任务。目前，肠致病性大肠杆菌的检测方法主要有三大类：传统的培养计数法、分子生物学检测方法和免疫学检测方法。传统培养检测方法被视为肠致病性大肠杆菌检测的金标准，它是将细菌经过分离培养后，在特定的培养基中观察细菌的菌落形态、颜色变化和生化反应。这种方法检测成本低，操作相对简单，但该方法检测耗时需72-120h，限制了该方法的广泛应用。聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction,PCR)是典型的分子生物学检测方法，此方法相对于传统方法来说，检测时间大大缩短，一般只需5-24h即可完成。它的特点是能将微量的DNA进行大幅扩增，然后将扩增的DNA进行杂交检测。这种方法灵敏度较高，但需要专业的技术人员操作，且极易产生假阳性结果，也在一定程度上限制了它的应用。免疫学检测方法中最常用的是酶联免疫吸附技术(ELISA，enzymelinkedimmunosorbentassay)，这种方法是用酶作为标记物，以抗原和抗体之间免疫结合反应为基础的固相吸附测定方法。这种方法使用简单、快速，但检测限较高，在含低浓度细菌样品检测中应用受限，且抗体的免疫原性、基体耐药性和不稳定性等缺点极大的限制了该方法的应用和发展。电化学方法由于其灵敏度高、费用低廉、操作简单易行，在分析检测领域应用很广。但是传统的裸电极带来的电沉积现象和高的过电位是分析工作者尽量避免的，修饰电极的方法可以提高分析测定的灵敏度，从而扩大电化学检测的应用范围和提升应用效果。适配体是一类经过指数富集配体系统进化技术，从体外筛选得到的能与蛋白和其他小分子发生特异性结合的单链寡聚核苷酸。适配体具有易合成、易修饰、高稳定性、高亲和性和高特异性等优点，已经作为电极修饰材料在分析测试中获得了比较好的应用效果。目前，运用适配体电化学传感器对肠致病性大肠杆菌进行分析检测的文献还比较少。丁世家教授课题组选用能与肠致病性大肠杆菌细胞壁上脂多糖发生高选择性结合的L9F核酸适配体，制备得到电流型-电化学传感器，对肠致病性大肠杆菌进行快速检测，取得了较好的应用效果。但是该方法中电化学传感器的制备过程比较繁琐，还需要进一步简化。
技术实现思路
本专利技术实施例的目的在于提供一种用于检测肠致病性大肠杆菌的核酸适配体电化学传感器，以实现肠致病性大肠杆菌的快速检测；本专利技术还提供了所述检测器的制备方法和应用。具体技术方案如下：本专利技术第一方面提供了一种检测肠致病性大肠杆菌的核酸适配体电化学传感器，包括通过S-Au键连接于金电极表面的捕获探针，以及与捕获探针杂交形成双链的信号探针；所述捕获探针为巯基修饰的核酸适配体：SH-(Xm)n-CAGATGCACGACTTCGAGTCTTAGGGCACACGATGGCAGT；所述信号探针为生物素修饰的核酸适配体：Biotin-CAGCTCAGAAGCTTGATCCTACCAGTAGACTTTCAACTTTACTGCCATCGTGTGCCCTAAGACTCGAAGTCGTGCATCTG；其中，n＝0或1；X代表-CH2-或A、T、C、G，当X为-CH2-时，m＝6；当X为A、T、C或G时，m＝4～10。本专利技术第二方面提供了一种如本专利技术第一方面所述的检测肠致病性大肠杆菌的核酸适配体电化学传感器的制备方法，包括以下步骤：S1：对金电极预处理，去除金电极表面杂质；S2：将预处理后的金电极与所述捕获探针的水溶液反应，得到表面通过S-Au键固定有捕获探针的金电极；S3：表面连有捕获探针的金电极经清洗液清洗后，置于封闭液中，以封闭未结合捕获探针的金电极表面；S4：封闭后的金电极经清洗液清洗后，与所述信号探针的水溶液反应，使信号探针结合于捕获探针上，得到传感器。在本专利技术第二方面的一些实施方式中，金电极的预处理包括：1)先后用0.3mm和0.05mm铝粉抛光金电极表面；2)依次用超纯水、食人鱼溶液、超纯水分别超声清洗5分钟；3)在1mol/L的硫酸中进行循环伏安法电化学扫描，直到出现稳定的峰形。在本专利技术第二方面的一些实施方式中，S2中捕获探针水溶液的浓度为2μmol/L，反应条件为4℃过夜。在本专利技术第二方面的一些实施方式中，S3、S4中的清洗液成分包含：Tris-HCl20mmol/L、NaCl0.1mol/L、KCl0.1mol/L、MgCl25.0mmol/L及吐温-200.005％v/v；所述清洗液的pH为7-8。在本专利技术第二方面的一些实施方式中，S3中的封闭液为2mmol/L巯基己醇水溶液；封闭条件为：37℃静置反应(0.8-1.2)小时。在本专利技术第二方面的一些实施方式中，S4中信号探针水溶液的浓度为(3-5)μmol/L，反应条件为37℃反应1小时。在本专利技术第二方面的一些实施方式中，在步骤S4，将封闭后的金电极用清洗液清洗之前，还包括：先后采用鲑鱼精DNA溶液和牛血清白蛋白溶液淋洗金电极，以封闭金电极表面的非特异性位点。本专利技术第三方面提供了一种采用本专利技术第一方面所述的核酸适配体电化学传感器检测肠致病性大肠杆菌的方法，包括以下步骤：a1：将所述传感器分别浸泡在含有已知浓度为C1-Cn的肠致病性大肠杆菌的PBS溶液中反应；使信号探针与肠致病性大肠杆菌结合；a2:清洗液清洗反应后的传感器，并将清洗后的传感器分别与链霉菌抗生物素蛋白-碱性磷酸酶水溶液反应；a3:将连接有链霉菌抗生物素蛋白-碱性磷酸酶的传感器用PBST溶液冲洗后，分别浸泡于1-萘基磷酸盐-二乙醇胺水溶液中，并运用电化学工作站进行差分脉冲伏安法测量，记录峰电流值；a4:以峰电流值为纵坐标或横坐标，以肠致病性大肠杆菌浓度C1-Cn的对数值为横坐标或纵坐标建立标准曲线，得到肠致病性大肠杆菌浓度对数值与峰电流值间的线性方程；a5:以待测样品溶液代替肠致病性大肠杆菌PBS溶液，执行a1，a2，a3，获得峰电流值，根据a4中的线性方程确定待测样品溶液中肠致病性大肠杆菌的浓度。在本专利技术第三方面的一些实施方式中，所述链霉菌抗生物素蛋白-碱性磷酸酶水溶液的浓度为(0.1-1.0)mg/mL；所述1-萘基磷酸盐-二乙醇胺水溶液中1-萘基磷酸盐的浓度为(0.2-2.0)mg/mL，二乙醇胺的体积分数为2.5％。本专利技术实施例提供的一种核酸适配体电化学传感器，可以用于肠致病性大肠杆菌的检测，采用该传感器检测大肠杆菌，与现有检测方法相比，用时较少且操作更加便捷。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为本专利技术检测原理示意图；图2为传感器不同制备阶段的电本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种检测肠致病性大肠杆菌的核酸适配体电化学传感器，其特征在于：包括通过S‑Au键连接于金电极表面的捕获探针，以及与捕获探针杂交形成双链的信号探针；所述捕获探针为巯基修饰的核酸适配体：SH‑(Xm)n‑CAG ATG CAC GAC TTC GAG TCT TAG GGC ACA CGA TGG CAG T；所述信号探针为生物素修饰的核酸适配体：Biotin‑CAG CTC AGA AGC TTG ATC CTA CCA GTA GAC TTT CAA CTT TAC TGC CAT CGT GTG CCC TAA GAC TCG AAG TCG TGC ATC TG；其中，n＝0或1；X代表‑CH2‑或A、T、C、G，当X为‑CH2‑时，m＝6；当X为A、T、C或G时，m＝4～10。
【技术特征摘要】
1.一种检测肠致病性大肠杆菌的核酸适配体电化学传感器，其特征在于：包括通过S-Au键连接于金电极表面的捕获探针，以及与捕获探针杂交形成双链的信号探针；所述捕获探针为巯基修饰的核酸适配体：SH-(Xm)n-CAGATGCACGACTTCGAGTCTTAGGGCACACGATGGCAGT；所述信号探针为生物素修饰的核酸适配体：Biotin-CAGCTCAGAAGCTTGATCCTACCAGTAGACTTTCAACTTTACTGCCATCGTGTGCCCTAAGACTCGAAGTCGTGCATCTG；其中，n＝0或1；X代表-CH2-或A、T、C、G，当X为-CH2-时，m＝6；当X为A、T、C或G时，m＝4～10。2.一种如权利要求1所述的检测肠致病性大肠杆菌的核酸适配体电化学传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：对金电极预处理，去除金电极表面杂质；S2：将预处理后的金电极与所述捕获探针的水溶液反应，得到表面通过S-Au键固定有捕获探针的金电极；S3：表面连有捕获探针的金电极经清洗液清洗后，置于封闭液中，以封闭未结合捕获探针的金电极表面；S4：封闭后的金电极经清洗液清洗后，与所述信号探针的水溶液反应，使信号探针结合于捕获探针上，得到传感器。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，金电极的预处理包括：1)先后用0.3mm和0.05mm铝粉抛光金电极表面；2)依次用超纯水、食人鱼溶液、超纯水分别超声清洗5分钟；3)在1mol/L的硫酸中进行循环伏安法电化学扫描，直到出现稳定的峰形。4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，S2中捕获探针水溶液的浓度为2μmol/L，反应条件为4℃过夜。5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，S3、S4中的清洗液成分包含：Tris-HCl20mmol/L、NaCl0.1mol/L、KCl0.1mol/L、M...
【专利技术属性】
技术研发人员：王海霞，赵堉文，李正，贾广成，
申请(专利权)人：天津中医药大学，张春，
类型：发明
国别省市：天津,12
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。