一种利用真眼点藻纲微藻生产棕榈油酸的方法技术

本发明专利技术公开一种利用真眼点藻纲微藻生产棕榈油酸的方法，涉及微藻生物资源与生物技术领域。该制备方法包括总脂的提取、棕榈油酸的浓缩等步骤。本发明专利技术利用类波氏真眼点藻(E.cf.polyphem)生产棕榈油酸具有绿色、安全的优势，而原料来源不受地理限制、无季节限制、全年持续采收，可以满足巨大的原料缺口。本发明专利技术提供一种高效浓缩微藻棕榈油酸的制备方法，该方法操作简单、高效、成本低且棕榈油酸纯度高，可适合大规模生产，为促进微藻来源的棕榈油酸产品的商业化发展奠定基础。

【技术实现步骤摘要】
一种利用真眼点藻纲微藻生产棕榈油酸的方法
本专利技术涉及微藻生物资源与生物
，具体是指一种利用真眼点藻纲微藻生产棕榈油酸的方法。
技术介绍
棕榈油酸(C16:1ω7，palmitoleicacid)是一种由十六个碳原子构成且含有一个ω-7不饱和双键的单不饱和脂肪酸，结构式见式1。近些年，大量生物学研究发现棕榈油酸在生物体内的糖脂代谢平衡中扮演着重要角色，而且该脂肪酸对一些慢性疾病，诸如肥胖、糖尿病、血脂障碍、炎症和动脉粥样硬化等都具有一定的治疗效果。因此，它的医药保健价值逐渐引起了人们的关注。我国人口结构已经进入老龄化，患有糖尿病、“三高”等慢性代谢综合征的人口基数庞大，势必会对以棕榈油酸为主的药物产生巨大需求。陆生油料作物中棕榈油酸含量一般较低，而富含棕榈油酸的主要是一些野生植物，如沙棘和澳洲坚果。其中，澳洲坚果籽油中的棕榈油酸含量约占总脂肪酸的30％，而沙棘果肉中的棕榈油酸含量为其总脂肪酸的40％。然而，这些高含棕榈油酸的植物大多存在种子小，产量低以及地理分布窄的问题，使得它们不适合大规模的种植和生产。鲸油和鱼肝油等海产品也是棕榈油酸重要的动物性来源。但是，随着国际上禁止捕鲸及渔业资源的匮乏，使得棕榈油酸的来源也非常有限。因此，迫切需要寻找一种适合天然棕榈油酸大规模生产的新来源解决市场的需求。微藻，是一类系统发生各异、生境分布广、能进行光合作用的低等植物，它是自然界中起源最早，种类和数量最多的生物质资源。在目前已分离的藻株中，颤藻(Oscillatoriasp.)、湖生拟纳绿球藻(Nannochloropsislimnetica)、黄丝藻(Tribonemasp.)、巴夫藻(Pavlovalutheri)、集胞藻(Synechocystissp.)和三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)等都能在一定的培养条件下积累大量的棕榈油酸，其含量一般可以达到总脂肪酸含量的25％～50％。本实验室保藏有真眼点藻纲(Eustigmatophyceae)十几株微藻，它们均能在氮胁迫条件下高度积累棕榈油酸，特别是一株类波氏真眼点藻(Eustigmatoscf.polyphem)，该藻株在氮胁迫条件下，除了能够保持较快的生长速度，而且棕榈油酸含量可以超过总脂肪酸含量58％及干重的29％，是目前报道棕榈油酸含量最高的藻株，具有适合规模化生产棕榈油酸的潜力。目前，棕榈油酸的相关产品主要来自于植物沙棘，多利用超临界萃取或者分子蒸馏的方式从中提取和制备棕榈油酸，而对于微藻中棕榈油酸的制备报道较少，只有国外一项专利：Omega7richcompositionsandmethodsofisolationomega7fattyacids(Shinde，US9200236B2)，采用的是分子蒸馏技术。超临界萃取和分子蒸馏方式虽然都可以应用于微藻棕榈油酸的提取与浓缩，但是成本较高，不适合大规模生产，而且棕榈油酸的纯度不高。
技术实现思路
为了克服现有技术的缺点与不足，本专利技术的目的在于提供一种利用真眼点藻纲微藻生产棕榈油酸的方法，可以实现棕榈油酸的高效生产。本专利技术的制备方法操作简单、成本低廉、产品纯度高，为促进微藻来源的棕榈油酸产品的商业化发展奠定基础。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种利用真眼点藻纲微藻生产棕榈油酸的方法，包括如下步骤：(1)总脂的提取：取冻干藻粉与95％乙醇混合后，持续超声处理2～3h；然后，藻粉混合液于50℃～60℃恒温水浴条件下磁力搅拌提取总脂；(2)棕榈油酸的浓缩：将步骤(1)获得的总脂先后经过皂化、低温冷冻沉淀、酸解和尿素包埋等过程处理，即获得高浓度的棕榈油酸。优选的，所述的真眼点藻纲微藻为类波氏真眼点藻(E.cf.polyphem)，但不限于此，比如大真眼点藻(Eustigmatosmagnus)、魏氏真眼点藻(Eustigmatosvischeri)、斧形魏氏藻(Vischeriahelvetica)、星形魏氏藻(Vischeriastellata)、眼点拟微绿球藻(Nannochloropsisoculata)等；所述的冻干藻粉为最佳氮浓度条件下的真眼点藻纲微藻冻干藻粉。优选的，所述的冻干藻粉为最佳氮浓度条件下的类波氏真眼点藻(E.cf.polyphem)冻干藻粉。所述的冻干藻粉与95％乙醇混合为按照m/v＝1:30～1:40的比例进行混合；优选按照m/v＝1:30的比例进行混合；所述的藻粉混合液于50℃～60℃恒温水浴条件下磁力搅拌提取总脂的步骤如下：藻粉混合液于50℃～60℃恒温水浴条件下磁力搅拌提取油脂，该过程至少重复三次；而收获的上清合并后，除去乙醇，即得到总脂；优选的，所述的藻粉混合液于50℃～60℃恒温水浴条件下磁力搅拌提取总脂的具体步骤如下：藻粉混合液于50℃～60℃恒温水浴条件下磁力搅拌(150～250rpm，优选为200rpm)提取油脂4～6h(优选为4h)；提取结束后，离心(3500～5000rpm离心5～10min，优选为3500rpm离心5min)收集上清，而藻体继续重复上述提取步骤3～4次；而收获的上清合并后，除去有机试剂，即得到总脂；所述的棕榈油酸的浓缩的具体步骤如下：称取一定量的总脂与10％KOH-乙醇液体混合，置于70～80℃恒温水浴中磁力搅拌皂化1.0～1.5h；待皂化液冷却至室温后，放入-20℃中静置24～36h；低温冷冻处理后，分离混合液中的固体相(不溶物)和液体相(滤液)，收集液体相；上述的液体相加入正己烷反复提取，分相并收集液体相层，然后缓慢加入浓盐酸使得溶液pH＝1～2，不饱和的脂肪酸盐酸解生成游离脂肪酸；通过去离子水反复洗涤后，40℃～50℃真空旋转蒸发获得游离不饱和脂肪酸；称取一定质量的游离不饱和脂肪酸和尿素、95％乙醇混合后，置于50℃恒温水浴中搅拌直至溶液变得澄清，随后放入4℃中尿素包埋36～48h；尿素包埋结束后，同样抽滤得到获得尿素结晶，50℃热水溶解后，并用正己烷萃取；正己烷相经去离子水洗涤后真空旋转蒸发(40℃～50℃)，即得到高浓度的棕榈油酸。优选的，所述的棕榈油酸的浓缩的具体步骤如下：称取一定量的总脂与10％KOH-乙醇液体混合，置于70℃恒温水浴中磁力搅拌皂化1.0h；待皂化液冷却至室温后，放入-20℃中静置24h；低温冷冻处理后，分离混合液中的固体相(不溶物)和液体相(滤液)，收集液体相；上述的液体相加入正己烷反复提取，分相并收集液体相层，然后缓慢加入浓盐酸使得溶液pH＝2，不饱和的脂肪酸盐酸解生成游离脂肪酸；通过去离子水反复洗涤后，40℃℃真空旋转蒸发获得游离不饱和脂肪酸；称取一定质量的游离不饱和脂肪酸和尿素、95％乙醇混合后，置于50℃恒温水浴中搅拌直至溶液变得澄清，随后放入4℃中尿素包埋48h；尿素包埋结束后，同样抽滤得到获得尿素结晶，50℃热水溶解后，并用正己烷萃取；正己烷相经去离子水洗涤后真空旋转蒸发(40℃)，即得到高浓度的棕榈油酸。类波氏真眼点藻的培养温度为24～26℃，光照强度为30～320μmolphotonsm-2s-1，培养基为mBG-11液体培养基(0.08～1.5g/LNaNO3，0.02～0.06g/LK2HPO4，0.075～0.15g/LMgSO4·7H2O，0.0本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用真眼点藻纲微藻生产棕榈油酸的方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)总脂的提取：取冻干藻粉与95％乙醇混合后，持续超声处理2～3h；然后，藻粉混合液于50℃～60℃恒温水浴条件下磁力搅拌提取总脂；(2)棕榈油酸的浓缩：将步骤(1)获得的总脂先后经过皂化、低温冷冻沉淀、酸解和尿素包埋过程处理，即获得高浓度的棕榈油酸。

【技术特征摘要】
1.一种利用真眼点藻纲微藻生产棕榈油酸的方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)总脂的提取：取冻干藻粉与95％乙醇混合后，持续超声处理2～3h；然后，藻粉混合液于50℃～60℃恒温水浴条件下磁力搅拌提取总脂；(2)棕榈油酸的浓缩：将步骤(1)获得的总脂先后经过皂化、低温冷冻沉淀、酸解和尿素包埋过程处理，即获得高浓度的棕榈油酸。2.根据权利要求1所述的利用真眼点藻纲微藻生产棕榈油酸的方法，其特征在于：所述的真眼点藻纲微藻为类波氏真眼点藻(E.cf.polyphem)、大真眼点藻(Eustigmatosmagnus)、魏氏真眼点藻(Eustigmatosvischeri)、斧形魏氏藻(Vischeriahelvetica)、星形魏氏藻(Vischeriastellata)、眼点拟微绿球藻(Nannochloropsisoculata)。3.根据权利要求1或2所述的利用真眼点藻纲微藻生产棕榈油酸的方法，其特征在于：所述的冻干藻粉为最佳氮浓度条件下的真眼点藻纲微藻冻干藻粉。4.根据权利要求3所述的利用真眼点藻纲微藻生产棕榈油酸的方法，其特征在于：所述的冻干藻粉为最佳氮浓度条件下的类波氏真眼点藻(E.cf.polyphem)冻干藻粉。5.根据权利要求1或4所述的利用真眼点藻纲微藻生产棕榈油酸的方法，其特征在于：所述的冻干藻粉与95％乙醇混合为按照m/v＝1:30～1:40的比例进行混合。6.根据权利要求1所述的利用真眼点藻纲微藻生产棕榈油酸的方法，其特征在于：所述的藻粉混合液于50℃～60℃恒温水浴条件下磁力搅拌提取总脂的步骤如下：藻粉混合液于50℃～60℃恒温水浴条件下磁力搅拌提取油脂，该过程至少重复三次；而收获的上清合并后，除去乙醇，即得到总脂。7.根据权利要求1或6所述的利用真眼点藻纲微藻生产棕榈油酸的方法，其特征在于：所述的藻粉混合液于50℃～60℃恒温水浴条件下磁力搅拌提取总脂的具体步骤如下：藻粉混合液于50℃～60℃恒温水浴条件下150～250rpm磁力搅拌提取油脂4～6h；提取结束后，3500～5000rpm离心5～10min，收集上清，而藻体继续重复上述提取步骤3～4次；而收获的上清合并后，除去有机试剂，即得到总脂。8.根据权利要求1或2所述的利用真眼点藻纲微藻生产棕榈油酸的方法，其特征在于：所述的棕榈油酸的浓缩的具体步骤如下：称取一定量的总脂与10％KOH-乙醇液体混合，置于70～80℃恒温水浴中磁力搅拌皂化1.0～1.5h；待皂化液冷却至室温后，放入-20℃中静置24～36h；低温冷冻处理后，分离混合液中的固体相和液体相，收集液体相；上述的液体相加入正己烷反复提取，分相并收集液体相层，然后缓慢加入浓盐酸使得溶液pH＝1～2，不饱和的脂肪酸盐酸解生成游离脂肪酸；通过去离子水反复洗涤后，40℃～50℃真空旋转蒸发获得游离不饱和脂肪酸；称取一定质量的游离不饱...

【专利技术属性】
技术研发人员：张成武，王飞飞，高保燕，黄罗冬，
申请(专利权)人：暨南大学，
类型：发明
国别省市：广东,44