一种血红蛋白样品的细菌内毒素检测方法技术

本发明专利技术公开了一种血红蛋白样品的细菌内毒素检测方法，包括如下步骤：a用G因子阻断剂溶解鲎试剂干粉；b将血红蛋白样品稀释20‑40倍；c将步骤a和b中得到的反应物充分混合均匀后，于37℃孵育，监测660nm处的吸光度，进行细菌内毒素检测。步骤a中采用的G因子阻断剂为在纯化水中加入抑肽酶和茯苓多糖，使每毫升阻断剂溶液中含5ug‑15ug抑肽酶和10mg‑20mg茯苓多糖。本发明专利技术的血红蛋白样品的细菌内毒素检测方法，检测限低，准确度高，操作简单，能够实现对血红蛋白样品细菌内毒素的精确检测。

【技术实现步骤摘要】
一种血红蛋白样品的细菌内毒素检测方法
本专利技术属于药物检测
，具体涉及一种血红蛋白样品的细菌内毒素检测方法。
技术介绍
内毒素是革兰氏阴性菌的菌体中存在的毒性物质的总称，其主要成分为磷脂多糖，可引起发热，因此也被称为‘热源’。内毒素是生物制品的潜在污染物，对大输液产品而言，需要一种可靠、有效的方法对内毒素残留进行定量。内毒素的检测方法可分为凝胶法和光度测定法。凝胶法是通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来进行定性检测或半定量检测。光度测定法包括浊度法和显色基质法，进一步分为终点浊度法、动态浊度法、终点显色法和动态显色法。终点浊度法是依据反应混合物中的内毒素浓度和其在孵育终止时的浊度(吸光度或透光率)之间存在的量化关系来测定内毒素含量的方法。动态浊度法是检测反应混合物的浊度到达某一预先设定的吸光度或透光率所需的反应时间，或是检测浊度增加速度的方法。终点显色法是依据反应混合物中内毒素浓度和其在孵育终止时释放出的呈色团的量之间存在的量化关系来测定内毒素含量的方法。动态显色法是检测反应混合物的吸光度或透光率达到某一预先设定的检测值所需要的反应时间，或检测值增加速度的方法。血红蛋白是高等生物体内负责运载氧的蛋白质，也是红细胞中唯一的非膜蛋白。血红蛋白是一种含铁的复合变构蛋白，由血红素和珠蛋白构成。经过一系列分离纯化工艺制备的血红蛋白样品具有特殊性，已经从红细胞中释放出来的血红蛋白，以溶解状态存在于溶液中，由于血红蛋白样品有很深的颜色，会对细菌内毒素的检测产生强烈干扰，目前还没有对血红蛋白样品的细菌内毒素进行检测的报道。中国专利CN102901726公开了一种血液细菌内毒素检测试剂盒的制备和应用，在采用该专利技术的试剂盒进行血液细菌内毒素检测时需要先对血液样品进行离心处理，经过离心处理后消除了血液中的红细胞，从而消除了血红蛋白对细菌内毒素检测的影响，采用该试剂盒无法对血红蛋白样品进行内毒素检测。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种适用于检测血红蛋白样品中细菌内毒素的方法，实现对血红蛋白样品细菌内毒素的精确检测，以弥补这个领域的空白。为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种血红蛋白样品的细菌内毒素检测方法，其包括如下步骤：a用G因子阻断剂溶解鲎试剂干粉；b将血红蛋白样品稀释20-40倍；c将步骤a和b中得到反应物充分混合均匀后，于37℃孵育，监测660nm处的吸光度，进行内毒素检测。上述血红蛋白样品的细菌内毒素检测方法，其中，所述步骤a中G因子阻断剂为在纯化水中加入抑肽酶，使每毫升阻断剂溶液中含5ug-15ug抑肽酶。上述血红蛋白样品的细菌内毒素检测方法，其中，所述步骤a中G因子阻断剂为在纯化水中加入茯苓多糖，使每毫升阻断剂溶液中含10mg-20mg茯苓多糖。上述血红蛋白样品的细菌内毒素检测方法，其中，所述步骤a中G因子阻断剂为在纯化水中加入抑肽酶和茯苓多糖，使每毫升阻断剂溶液中含5ug-15ug抑肽酶和10mg-20mg茯苓多糖。上述血红蛋白样品的细菌内毒素检测方法，其中，所述步骤a中所述G因子阻断剂与鲎试剂的配比为1ml的G因子阻断剂溶解1-3ug鲎试剂粉末。上述血红蛋白样品的细菌内毒素检测方法，其中，所述步骤c中，所述步骤a得到的鲎试剂溶液与所述步骤b得到的血红蛋白样品的加入体积比为1:4-5。上述血红蛋白样品的细菌内毒素检测方法，其中，所述步骤b中用内毒素检查用水稀释血红蛋白样品。上述血红蛋白样品的细菌内毒素检测方法，其中，所述步骤b中用内毒素检查用水将血红蛋白样品稀释20倍。上述血红蛋白样品的细菌内毒素检测方法，其中，所述步骤c中孵育时间为3小时。上述血红蛋白样品的细菌内毒素检测方法，其中，采用鲎试剂动态浊度法进行内毒素检测。本专利技术的血红蛋白样品的细菌内毒素检测方法具有如下有益效果：1、本专利技术中将血红蛋白样品稀释20-40倍，能够最大程度降低样品中可能存在的对细菌内毒素检测的各种干扰，并且本专利技术的方法无需对血红蛋白样品进行预处理，能够实现对血红蛋白样品细菌内毒素的定量检测，方法简单易行，灵敏度高，最低检测限达到0.001EU/ml；2、本专利技术的检测方法中采用由抑肽酶和茯苓多糖组成的复合G因子阻断剂，充分抑制了血红蛋白样品中结构类似β-D-葡聚糖物质的干扰，避免了假阳性的出现，采用外加已知浓度内毒素的方法进行准确度测试，回收率达到90-130％，远远高于国际标准50-200％的要求，检测结果更加准确。3、本专利技术中采用鲎试剂动态比浊法，测量660nm处的吸收值，最大程度降低了血红蛋白的干扰，灵敏度高，实现了对血红蛋白样品内毒素的精确检测。4、本专利技术中每次检测都有标准曲线、阳性对照、阴性对照、检测样品，一次检测3个小时内可以同时检测二十多个样品，并且每个样品3个平行，检测方法快速、准确，极大的提高了检测效率。附图说明图1为内毒素标准品曲线图。具体实施方式下面结合附图和实施例详细描述本专利技术。实施例1一、用内毒素检查用水配制内毒素标准液。1.取一瓶内毒素，将金属盖移去，慢慢打开瓶塞，用1000ul移液器加入内毒素检查用水5.0ml，盖好瓶塞，用封口膜封好，在漩涡振荡器上混匀，每隔5min混匀一次，每次1min，共60-120min。浓度为1000EU/ml。2.在无热原的试管中，加入内毒素检查用水1800ul，加入步骤1.样品200ul,在漩涡振荡器上混匀约1min。浓度为100EU/ml。3.在无热原的试管中，加入内毒素检查用水1800ul，加入步骤2.样品200ul,在漩涡振荡器上混匀约1min。浓度为10EU/ml。4.在无热原的试管中，加入内毒素检查用水1800ul，加入步骤3.样品200ul,在漩涡振荡器上混匀约1min。浓度为1EU/ml。5.在无热原的试管中，加入内毒素检查用水360ul，加入步骤4.样品640ul,在漩涡振荡器上混匀约1min。浓度为0.64EU/ml。6.标准曲线样品制备，内毒素标准品曲线见图1。按表1在试管中分别加入内毒素标准品，并在漩涡振荡器上混匀1min。表1内毒素标准品检测准确度见表2，每个内毒素标准品含3个平行样。表2二、用G因子阻断剂溶解鲎试剂干粉1、配制G因子阻断剂：在纯化水中加入抑肽酶，使每毫升阻断剂溶液中含10ug抑肽酶；2、在10ug鲎试剂干粉中加入配置好的G因子阻断剂5.0ml，轻轻混匀，使用前静止至少5min。三、血红蛋白样品的制备1.血红蛋白样品的制备：在无热原的试管中，加入内毒素检查用水1950ul，加入血红蛋白待测样品50ul，在漩涡振荡器上混匀1min，血红蛋白样品稀释倍数为40倍；2.血红蛋白样品阳性对照的制备：在无热原的试管中，加入内毒素检查用水1925ul，加入血红蛋白待测样品50ul，再加入0.64EU/ml的内毒素标准品25ul，在漩涡振荡器上混匀1min，血红蛋白样品阳性对照稀释倍数为40倍；3.阴性对照样品的制备：在无热原的试管中，加入内毒素检查用水2ml。四、检测1.打开仪器，预热30min，使温度恒定在37℃，测定波长为660nm；2.连接系统分析软件，设置仪器参数，反应时间为180min，填写标准曲线、样品及阳性对照名称和稀释倍数，填写鲎试剂与内毒素检查用水的批号；3.阴性对照：取内毒素检查用水200ul置反应小本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种血红蛋白样品的细菌内毒素检测方法，其包括如下步骤：a用G因子阻断剂溶解鲎试剂干粉；b将血红蛋白样品稀释20‑40倍；c将步骤a和b中得到的反应物充分混合均匀后，于37℃孵育，监测660nm处的吸光度，进行细菌内毒素检测。

【技术特征摘要】
1.一种血红蛋白样品的细菌内毒素检测方法，其包括如下步骤：a用G因子阻断剂溶解鲎试剂干粉；b将血红蛋白样品稀释20-40倍；c将步骤a和b中得到的反应物充分混合均匀后，于37℃孵育，监测660nm处的吸光度，进行细菌内毒素检测。2.如权利要求1所述的血红蛋白样品的细菌内毒素检测方法，其中，所述步骤a中G因子阻断剂为在纯化水中加入抑肽酶，使每毫升阻断剂溶液中含5ug-15ug抑肽酶。3.如权利要求1所述的血红蛋白样品的细菌内毒素检测方法，其中，所述步骤a中G因子阻断剂为在纯化水中加入茯苓多糖，使每毫升阻断剂溶液中含10mg-20mg茯苓多糖。4.如权利要求1所述的血红蛋白样品的细菌内毒素检测方法，其中，所述步骤a中G因子阻断剂为在纯化水中加入抑肽酶和茯苓多糖，使每毫升阻断剂溶液中含5ug-15ug抑肽酶和10mg-20mg茯苓多糖。5...

【专利技术属性】
技术研发人员：游可为，闫晓玲，孙新宇，刘迎，史国营，陈浩源，
申请(专利权)人：润方北京生物医药研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11