一种异宗结合蕈菌多孢子分离方法技术

本发明专利技术涉及食药用真菌的菌种分离、选育方法，具体为一种异宗结合蕈菌多孢子分离方法，主要以复等位基因理论为基础，通过从多丛菇丛选择的多只菇体获得多块种菇块，通过培养获得多个孢子印，再通过孢子液移接培养形成菌落，经过两次纯化后获得纯培养物，本发明专利技术的整个分离操作周期短，获得的单核菌丝的交配亲和率高，大量的节约了培养基材料、试管及制作成本和时间，极大的提高了效率。

【技术实现步骤摘要】
一种异宗结合蕈菌多孢子分离方法
本专利技术涉及食药用真菌的菌种分离、选育方法，尤其涉及一种异宗结合蕈菌多孢子分离方法。
技术介绍
食药用真菌尤其是四极性异宗结合真菌的菌种分离、选育，通常分为：有性分离和无性分离两种，而有性分离又分为单孢分离和多孢子分离。传统的多孢分离方法包括：采集器多孢分离法、钩悬法、以及菌褶涂抹法、空中孢子捕捉法等等。它们是采用某整朵主要子实体或子实体的一部分作为分离材料通过分离以获取多孢子的。其实质是从一颗子实体中分离得到其多个孢子，它们的性型为А1В1、А2В2或АαВα、АβВβ用它们所萌发出的单倍单核菌丝(初生菌丝)，在进行杂交配对时仅有25﹪的组合为完全可亲和性,即АαВαАβВβ具可结实性；有25﹪的组合为完全不可亲和性(即A＝B＝)；有25﹪的A＝B≠的“F”(Flat)；有25﹪的A≠B的“B”(Barrage)。而且，在上述的交配反应以及菌落中，其完全可亲和的“+”、完全不可亲和的“-”及半可亲和性的“F”、半可亲和性的“B”等菌落交织混合在一起。换言之，也就说用上述传统的多孢分离方法，移接入斜面培养基或平板培养基上的多孢子，其萌发，生长并随即交配而生长的菌苔中，将同时混杂有“+”、“-”、“F”、“B”等不同的菌落，而且在这样的菌苔中具有可结实性的完全可亲和的“+”菌落仅占有四分之一的比例。综上所述，用传统的多孢分离技术方法在对四极性异宗结合真菌进行有性分离、选育菌种时，一株菌株就需要消耗二百多支试管斜面培养基，至少需进行一次多孢分离操作，菌落筛选一次以上，挑取菌落数十个，菌丝尖端提纯、纯化三次以上，试管及基质材料利用率20％以下，耗时三至四个月以上甚至更久，而且选育工作后期的分离物生理性能测定出菇试验、初筛复筛的工作量大，人力物力消耗多且周期长。此外，操作复杂、可靠性低、成功率差、费用高以及分离物变异性大是其显著的标志。
技术实现思路
针对现有技术中存在的不足，本专利技术提供了一种异宗结合蕈菌多孢子分离方法。具体步骤为：在无菌的条件下，分别从同一品种的多丛菇丛中选择多只优质菇体，分别沿着所述多只优质菇体的菌盖外缘各切取4-6厘米见方的种菇块，使所述种菇块菌褶(子实层体)向下、菌盖向上的平放于同一孢子采集器的种菇支座上，并封闭孢子采集器。将所述孢子采集器置于生化培养箱中培养，获得多个孢子印(通常为三个孢子印)。向所述孢子印中加入无菌水，使孢子印分散而获得孢子混合液，并筛选获得优质孢子液，将所述孢子液移接至试管斜面培养基上，并置于生化培养箱内培养6-12天，获得菌落。对所述菌落进行筛选，将筛选的豌豆大小的菌丝洁白、光亮、浓密且健壮旺盛的独立分布的优质菌落移接至试管斜面培养基上，并置于生化培养箱内培养4-8天，获得优质菌苔。对所述优质菌苔进行尖端提纯纯化，将提纯纯化的接种物经培养，选取菌丝生长浓密、茁长、旺盛、且洁白光亮以及生长平展且前端整齐的优质尖端菌丝移接至试管斜面培养基上并置于生化培养箱中，培养至菌苔生长至3-4厘米；重复所述提纯过程，即可得多孢分离、选育的纯培养物。所述优质菇体为个大、健硕、茁壮并具有典型的该品种生物学特性的菇体。所述的多丛菇丛为3丛菇丛。所述获得孢子印的培养条件为：温度24-27℃、相对湿度70％、弱散射光、培养时间为8-10h。所述筛选优质孢子液的方法，具体包括以下步骤：将所述孢子混合液充分摇晃均匀后静置沉淀约10min后，用注射器吸取下层的含有发育完全、健全且饱满担孢子混合孢子液，将针头垂直向上，静置约10min，轻轻推动注射器排出上层约3ml液体，再次吸取约3ml的无菌水至注射器并再反复摇晃1分钟，再一次将注射器竖直放置10min，再轻轻推动注射器排出上层约2-5ml液体，即获得下层优质孢子液。所述的试管斜面培养基为CPDA培养基，其配方为：马铃薯200克、高凝琼脂粉20克、葡萄糖20g、磷酸二氢钾2g、硫酸镁0.5g、维生素В110mg、饮用水1000ml，PH6-7或自然。所述获得菌落、获得尖端菌丝、优质菌苔的培养条件为：温度24-27℃、相对湿度70％、无光。本专利技术的有益效果：(1)通过本专利技术的方法获得的单核菌丝的交配亲和率可达到95％以上，相较于传统方法的25％提高了70％以上，极大的提高了操作过程筛选的成功率。(2)培养时间缩短，成功率提高，极大的降低了工作量和培育成本。(3)采用本专利技术的孢子采集器，可以很好的形成一个担孢子弹射所需要的、最适宜的温度、光线、湿度以及新鲜空气的小环境。从而最大限度的提高了担孢子弹射的成功率、提高了担孢子采集的可靠性和高效性，而且操作安全方便、快捷高效。附图说明图1为孢子采集器内部结构示意图；图2为孢子采集器外部结构示意图。具体实施方式以下结合具体实施例对本专利技术进行进一步说明。下列所有的操作步骤均严格按照“NY/TF28-2002食用菌菌种生产规程”和“NY/T1098-2006食用菌品种描述技术规范”执行。所述的孢子采集器，包括托盘6和培养皿，所述培养皿包括培养皿盖4和培养皿底2，所述托盘内铺设有衬垫7，衬垫上放置有培养皿盖4，培养皿盖4的盖口朝下，培养皿盖顶部放置有培养皿底2，培养皿底2的开口朝上；所述培养皿底4内放置有种菇支座3；所述种菇支座3由一根金属丝绕制而成；所述衬垫7上放置穿刺针头；所述托盘6上位于培养皿外部扣设有防护罩1，所述托盘6和防护罩1外部设有外包裹层8，外包裹层顶部的开口处系有扎口纤维细绳9。具体结构详见说明书附图1和附图2。实施例1将所有器材和环境按标准进行清洁和消毒，以满足食用菌菌种培育的所需环境。选择四极性异宗结合蕈菌平菇，在无菌的条件下，分别从3丛菇丛中选择个大、健硕、茁壮并具有典型该品种的生物学特性的3只菇体，用消毒后的手术刀分别沿3只菇体的菌盖外缘取5厘米见方的3块种菇块，迅速使所述的3个种菇块的菌褶向下，菌盖向上的平放于孢子采集器的种菇支座上并盖好防护罩、拉起外包裹细纯棉纱布，捒住口部并用线绳扎紧。将孢子采集器移入生化培养箱中，在26℃、70％环境相对湿度以及弱散射光条件下培养10h，在培养皿皿底上即可形成3个孢子印。将孢子采集器转移至接种箱内，且取出已弹落有3处孢子印的培养皿皿底，并用皿盖盖上，取出穿刺针头，从包有注射器的包裹中取出玻璃注射器，安上穿刺针头由安瓿瓶中吸取约15ml的无菌水注进弹射有3处孢子印的培养皿底中，所述孢子印分散获得孢子混合液，将所述已充分混匀的孢子混合液静置沉淀10min后，用注射器吸取下层的混合孢子液，将针头垂直向上静置10min，轻轻推动注射器排出上层约3ml液体，再次吸取无菌水至注射器并反复摇晃1分钟，再一次将注射器竖直放置10min，再轻轻推动注射器排出上层约2-5ml液体，即获得下层优质孢子液。取分离用的CPDA试管斜面培养基，进行孢子液的移接，具体操作为：将分离用的斜面培养基的封口材料打开，将注射器针头沿试管壁从封口纸处插入管内至斜面尖端处，轻轻推注射器柄以使针尖能溢出三滴孢子液为度，抽出针头将注射器放好。轻轻旋转试管使接入的孢子液均匀分布于斜面基质上，盖上之前取下的塑料封口材料并用皮筋扎好，做好标记、标示。将已移接好、标记好了的所有试管培养基从无菌接种箱内取出，放入试管筐内在生化培养箱中以25℃、70％相对湿度及黑暗本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种异宗结合蕈菌多孢分离方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：在无菌的条件下，分别从同一品种的多丛菇丛中选择多只优质菇体，分别沿着所述多只优质菇体的菌盖外缘各割取4‑6厘米见方的种菇块，使所述种菇块菌褶子实层体向下、菌盖向上的平放于同一孢子采集器中，并密封所述孢子采集器；将所述孢子采集器置于生化培养箱中培养，获得多个孢子印；向所述孢子印中加入无菌水，使所述孢子印分散获得孢子混合液，并筛选获得优质孢子液，将所述筛选获得的优质孢子液移接至试管斜面培养基上，并置于生化培养箱内培养8‑12天，获得菌落；对所述菌落进行筛选，将筛选的豌豆大小的菌丝洁白、光亮、浓密且健壮旺盛的独立分布的优质菌落移接至试管斜面培养基上，并置于生化培养箱内培养4‑8天，获得尖端菌丝；对所述尖端菌丝进行提纯，将提纯的菌丝生长浓密、茁长、旺盛、且洁白光亮以及生长平展且前端整齐的优质菌苔移接至试管斜面培养基上并置于生化培养箱中，培养至菌苔生长至3‑4厘米；重复所述提纯过程，即可得多孢分离、选育的纯培养物。

【技术特征摘要】
1.一种异宗结合蕈菌多孢分离方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：在无菌的条件下，分别从同一品种的多丛菇丛中选择多只优质菇体，分别沿着所述多只优质菇体的菌盖外缘各割取4-6厘米见方的种菇块，使所述种菇块菌褶子实层体向下、菌盖向上的平放于同一孢子采集器中，并密封所述孢子采集器；将所述孢子采集器置于生化培养箱中培养，获得多个孢子印；向所述孢子印中加入无菌水，使所述孢子印分散获得孢子混合液，并筛选获得优质孢子液，将所述筛选获得的优质孢子液移接至试管斜面培养基上，并置于生化培养箱内培养8-12天，获得菌落；对所述菌落进行筛选，将筛选的豌豆大小的菌丝洁白、光亮、浓密且健壮旺盛的独立分布的优质菌落移接至试管斜面培养基上，并置于生化培养箱内培养4-8天，获得尖端菌丝；对所述尖端菌丝进行提纯，将提纯的菌丝生长浓密、茁长、旺盛、且洁白光亮以及生长平展且前端整齐的优质菌苔移接至试管斜面培养基上并置于生化培养箱中，培养至菌苔生长至3-4厘米；重复所述提纯过程，即可得多孢分离、选育的纯培养物。2.根据权利要求1所述一种异宗结合蕈菌多孢分离方法，其特征在于，所述优质菇体为个大、健硕、茁壮并具有典型生物学特性的菇体。3.根据权利要求1所述一种异宗结合蕈菌多孢分离方法，其特征在于，所述的多丛菇丛为3丛菇丛或3丛以上菇丛。...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖文智，
申请(专利权)人：西安圣鑫生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：陕西,61