一种促进黄曲霉菌快速产孢的方法技术

本发明专利技术公开了一种促进黄曲霉菌快速产孢的方法。以石墨烯掺杂的固体培养基作培养基，诱导黄曲霉菌的菌丝体快速产孢。本发明专利技术的优点是黄曲霉菌菌丝体产孢实验周期缩短，在48～72小时内能迅速诱导黄曲霉菌菌丝体大量产孢。为后期黄曲霉菌研究奠定良好基础，为科研工作者节约了大量的宝贵时间，具有较高的应用潜力。

【技术实现步骤摘要】
一种促进黄曲霉菌快速产孢的方法
本专利技术属于生命科学
，特别涉及一种黄曲霉菌的快速产孢方法。
技术介绍
由曲霉属真菌(特别是黄曲霉)引起的毒素污染统称曲霉菌毒素污染，寄主范围广，致使黄曲霉毒素广泛存在于大米、玉米、花生、芝麻、大豆、菜籽等粮油食品中，严重威胁人类的生命健康。目前，在实验室一般采用平板培养菌丝、自然产孢后制备黄曲霉菌孢子悬浮液，但其菌丝培养时间较长，通常需要7天，由于培养时间长，容易造成污染，菌丝产孢效率低，导致严重影响相关科研进度。关于黄曲霉菌孢子的研究极为普遍，它对黄曲霉毒素产生机理，作物抗侵染作用，以及生防菌或天然产物抑制机理等的研究极为重要。获得大量孢子的速度在很大程度上决定着黄曲霉毒素防控研究的进展。快速获得大量孢子，诱导黄曲霉菌产孢，可以为科研工作者提供充分的实验材料。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种简易可行的方法快速诱导黄曲霉菌菌丝体产孢。为了实现以上目的，本专利技术的技术方案如下：一种黄曲霉菌的快速产孢方法，以石墨烯掺杂的固体培养基作培养基，诱导黄曲霉菌的菌丝体快速产孢。按上述方案，所述的快速产孢方法具体为：将黄曲霉菌活化，转接到固体培养基培养，然后将培养得到的菌丝体移植到石墨烯掺杂的固体培养基上诱导产胞。按上述方案，所述诱导产胞的培养温度28±3℃，培养时间48～72h。按上述方案，所述石墨烯横向尺寸为5nm～5μm。具体可选择横向尺度500nm～5μm的大片层石墨烯，横向尺度5～200nm的小片层石墨烯。按上述方案，所述石墨烯优选为横向尺度5～200nm的小片层石墨烯，更优选为横向尺度5～15nm的小片层石墨烯。按上述方案，所述石墨烯掺杂的固体培养基的制备方法：石墨烯水溶液与经灭菌后还未完全冷却的固体培养基溶液混合，迅速摇匀后，倒入平板冷却制成。混合温度可为40-50℃。按上述方案，所述的石墨烯选择大片层石墨烯时，将大片层石墨烯按一定浓度溶于超纯水中，超声至均一后，再经过离心后取上清，经灭菌后制成石墨烯水溶液；所述的石墨烯选择小片层石墨烯时，将小片层石墨烯按一定浓度溶解在无菌水中，滤膜过滤后制成石墨烯水溶液。滤膜的孔径具体可为0.22μm。按上述方案，所述的灭菌为121℃灭菌30min。按上述方案，固体培养基是常规的真菌培养基，可以是PDA固体培养基、沙氏固体培养基、查氏固体培养基、曲霉素琼脂基础(AFPA)培养基、马铃薯蛋白固体培养基、燕麦片固体培养基、玉米粉固体培养基、麦芽浸膏固体培养基、胡萝卜固体培养基和黑麦固体培养基。按上述方案，PDA固体培养基配方：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，定容至1L。沙氏固体培养基配方：蛋白胨10g，琼脂20g，葡萄糖40g，定容至1L。查氏固体培养基配方：硝酸钠3g，磷酸氢二钾1g，硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.5g，氯化钾0.5g，硫酸亚铁0.01g，蔗糖30g，琼脂20g，定容至1L。AFPA固体培养基配方：蛋白胨10g、酵母浸粉20g、柠檬酸铁铵0.5g、氯硝铵0.002g、氯霉素0.1g、琼脂15g，定容至1L。马铃薯蛋白固体培养基配方：马铃薯300g、硝酸钙0.5g、磷酸氢二钠2g、蛋白胨5g、蔗糖15g、琼脂18g，定容至1L。燕麦片固体培养基配方：燕麦片50g、蔗糖5g、琼脂20g，定容至1L。玉米粉固体培养基配方：玉米粉80g、蔗糖5g、琼脂18g，定容至1L。麦芽浸膏固体培养基配方：麦芽浸膏25g、琼脂17g，定容至1L。胡萝卜固体培养基配方：胡萝卜200g、琼脂13g，定容至1L。黑麦固体培养基配方：黑麦种子50g、葡萄糖5g、琼脂13g，定容至1L。十种固体培养基均经过121度20-30min灭菌后制得。按上述方案，所述的石墨烯掺杂的固体培养基配方中：石墨烯的终浓度为0.25～2mg/ml。优选为0.5～1mg/ml。按上述方案，石墨烯掺杂的PDA固体培养基各组分的终浓度为：马铃薯200mg/ml，葡萄糖20mg/ml，琼脂20mg/ml，石墨烯0.25～2mg/ml；石墨烯掺杂的沙式固体培养基各组分的终浓度为：蛋白胨10mg/ml，琼脂20mg/ml，葡萄糖40mg/ml，石墨烯0.25～2mg/ml；石墨烯掺杂的查式固体培养基各组分的终浓度为：硝酸钠3mg/ml，磷酸氢二钾1mg/ml，硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.5mg/ml，氯化钾0.5mg/ml，硫酸亚铁0.01mg/ml，蔗糖30mg/ml，琼脂20mg/ml，石墨烯0.25～2mg/ml；石墨烯掺杂的AFPA固体培养基各组分的终浓度为：蛋白胨10mg/ml、酵母浸粉20mg/ml、柠檬酸铁铵0.5mg/ml、氯硝铵0.002mg/ml、氯霉素0.1mg/ml、琼脂15mg/ml，石墨烯0.25～2mg/ml；石墨烯掺杂的马铃薯蛋白固体培养基各组分的终浓度为：马铃薯300mg/ml、硝酸钙0.5mg/ml、磷酸氢二钠2mg/ml、蛋白胨5mg/ml、蔗糖15mg/ml、琼脂18mg/ml，石墨烯0.25～2mg/ml；石墨烯掺杂的燕麦片固体培养基各组分终浓度为：燕麦片50mg/ml、蔗糖5mg/ml、琼脂20mg/ml，石墨烯0.25～2mg/ml；石墨烯掺杂的玉米粉固体培养基各组分终浓度为：玉米粉80mg/ml、蔗糖5mg/ml、琼脂18mg/ml，石墨烯0.25～2mg/ml；石墨烯掺杂的麦芽浸膏固体培养基各组分终浓度为：麦芽浸膏25mg/ml、琼脂17mg/ml；石墨烯掺杂的胡萝卜固体培养基各组分终浓度为：胡萝卜200mg/ml、琼脂13mg/ml，石墨烯0.25～2mg/ml；石墨烯掺杂的黑麦固体培养基各组分终浓度为：黑麦种子50mg/ml、葡萄糖5mg/ml、琼脂13mg/ml，石墨烯0.25～2mg/ml。按上述方案，所述的黄曲霉菌产孢量为6.5×104～8.5×107个/ml(定容后的孢子悬浮液)，定容后的孢子悬浮液总量5ml。按上述方案，具体包括以下步骤：(1)将黄曲霉菌活化后转接到含有固体培养基的平板上，置于28℃恒温培养箱一段时间；(2)取处于菌落边缘的菌丝体移植到石墨烯掺杂的固体培养基的平板中；(3)将接种好菌丝的平板重新密封好于恒温培养箱中继续培养48～72h产孢；按上述方案，步骤(1)的培养时间为48-72h。按上述方案，步骤(2)的接种为待菌落长至直径为2～3cm时，用接种环取处于菌落边缘的菌丝体移植到石墨烯掺杂的固体培养基的平板中。按上述方案，产孢结束后，用吐温水溶液将孢子洗下，制成黄曲霉菌孢子悬浮液，所述的吐温水溶液为吐温-20用无菌水稀释1000倍后的水溶液。按上述方案，上述用吐温水溶液洗下孢子的次数为2～3次。本专利技术的优势在于：通过石墨烯诱导使黄曲霉菌菌丝体可快速产生大量孢子，大大提高其产孢率，黄曲霉菌产孢量为6.5×104～8.5×107个/ml定容后的孢子悬浮液(定容后的孢子悬浮液总量5ml)，缩短培养周期，从而为加快后续黄曲霉孢子相关研究奠定良好基础，有效节约了人力物力及科研工作者的大量宝贵时间，具有很高的应用价值。附图说明图1中a为普通固体培养基48h培养菌丝体的菌落图；b为添加小片层(5-15nm)石墨烯诱导材料后48h培养菌丝体的菌落图。由图可见，石墨烯诱导后只看见本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种黄曲霉菌的快速产孢方法，其特征在于：以石墨烯掺杂的固体培养基作培养基，诱导黄曲霉菌的菌丝体快速产孢。

【技术特征摘要】
1.一种黄曲霉菌的快速产孢方法，其特征在于：以石墨烯掺杂的固体培养基作培养基，诱导黄曲霉菌的菌丝体快速产孢。2.根据权利要求1所述的黄曲霉菌的快速产孢方法，其特征在于：所述的快速产孢方法具体为：将黄曲霉菌活化，转接到固体培养基培养，然后将培养得到的菌丝体移植到石墨烯掺杂的固体培养基上诱导产胞；所述诱导产胞的培养温度28±3℃，培养时间48～72h。3.根据权利要求1或2所述的黄曲霉菌的快速产孢方法，其特征在于：所述石墨烯横向尺寸为5nm～5μm。4.根据权利要求1或2所述的黄曲霉菌的快速产孢方法，其特征在于：所述石墨烯为横向尺度5～200nm的小片层石墨烯。5.根据权利要求1或2所述的黄曲霉菌的快速产孢方法，其特征在于：所述石墨烯为横向尺度5～15nm的小片层石墨烯。6.根据权利要求1或2所述的黄曲霉菌的快速产孢方法，其特征在于：所述石墨烯掺杂的固体培养基的制备方法：石墨烯水溶液与经灭菌后还未完全冷却的固体培养基溶液混合，迅速摇匀后，倒入平板冷却制成。7.根据权利要求1所述的黄曲霉菌的快速产孢方法，其特征在于：固体培养基是常规的真菌培养基，为PDA固体培养基、沙氏固体培养基、查氏固体培养基、曲霉素琼脂基础(AFPA)培养基、马铃薯蛋白固体培养基、燕麦片固体培养基、玉米粉固体培养基、麦芽浸膏固体培养基、胡萝卜固体培养基或黑麦固体培养基；PDA固体培养基配方：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，定容至1L；沙氏固体培养基配方：蛋白胨10g，琼脂20g，葡萄糖40g，定容至1L；查氏固体培养基配方：硝酸钠3g，磷酸氢二钾1g，硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.5g，氯化钾0.5g，硫酸亚铁0.01g，蔗糖30g，琼脂20g，定容至1L；AFPA固体培养基配方：蛋白胨10g、酵母浸粉20g、柠檬酸铁铵0.5g、氯硝铵0.002g、氯霉素0.1g、琼脂15g，定容至1L；马铃薯蛋白固体培养基配方：马铃薯300g、硝酸钙0.5g、磷酸氢二钠2g、蛋白胨5g、蔗糖15g、琼脂18g，定容至1L；燕麦片固体培养基配方：燕麦片50g、蔗糖5g、琼脂20g，定容至1L；玉米粉固体培养基配方：玉米粉80g、蔗糖5g、琼脂18g，定容至1L；麦芽浸膏固体培养基配方：麦芽浸膏25g、琼脂17g，定容至1L；胡萝卜固体培养基配方：胡萝卜200g、琼脂13g，定容至1L；黑麦固体培养基配方：黑麦种子50g、葡萄糖5g、琼脂13g，定容至1L。8.根据权利要求1或2所述的黄曲霉菌的快速产孢方法，其特征在于：所述的石墨烯掺杂的固体培养基中石墨烯的终浓度为0.25～2mg/ml。9.根据权利要求1或2所述的黄曲霉菌的快速产孢方法，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：喻理，李培武，杨代斌，张奇，朱婷婷，董雪丽，姜俊，
申请(专利权)人：中国农业科学院油料作物研究所，
类型：发明
国别省市：湖北,42