诊断肺癌骨转移的基因检测试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及诊断肺癌骨转移的基因检测试剂盒。虽然hsa_circ_0068527、hsa_circ_0084169、hsa_circ_0024887单独用于区分肺癌骨转移患者与肺癌未转移患者仅具有一定或较低的准确性，但是hsa_circ_0068527、hsa_circ_0084169、hsa_circ_0024887联合用于区分肺癌骨转移患者与肺癌未转移患者具有较高的准确性，准确率较高。因此，可以基于此制造用于诊断肺癌骨转移的基因检测试剂盒，该试剂盒中含有hsa_circ_0068527、hsa_circ_0084169和hsa_circ_0024887的实时荧光定量PCR引物(如表2)，还含有内参的实时荧光定量PCR引物，以及实时荧光定量PCR所需要的酶和试剂。

【技术实现步骤摘要】
诊断肺癌骨转移的基因检测试剂盒
本专利技术涉及肿瘤检测试剂盒，尤其涉及诊断肺癌骨转移的基因检测试剂盒。
技术介绍
肺癌是我国常见的恶性肿瘤之一，严重影响患者的生活质量和生命健康。骨转移是肺癌病情恶化的标志之一，若能够对患者是否发生骨转移进行准确的检测和诊断，对于临床给予对症治疗，改善治疗效果具有重要意义。肿瘤细胞在增殖过程中会主动释放或者合成部分肿瘤标志物，肿瘤细胞对宿主细胞的刺激也可致使宿主细胞产生肿瘤标志物。肿瘤标志物在辅助诊断肿瘤、检测患者病情变化和预后具有重要意义，但是肺癌患者的肿瘤标志物水平和骨转移之间的相关性研究较少，肺癌骨转移检测诊断试剂盒需求缺口很大。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供诊断肺癌骨转移的基因检测试剂盒。为实现上述目的，本专利技术提供了以下技术方案：用于诊断肺癌患者骨转移的基因检测试剂盒，含有hsa_circ_0068527、hsa_circ_0084169和hsa_circ_0024887的实时荧光定量PCR引物；其中，hsa_circ_0068527的实时荧光定量PCR上游引物如SequenceNO.9所示，其实时荧光定量PCR下游引物如SequenceNO.10所示；hsa_circ_0084169的实时荧光定量PCR上游引物如SequenceNO.11所示，其实时荧光定量PCR下游引物如SequenceNO.12所示；hsa_circ_0024887的实时荧光定量PCR上游引物如SequenceNO.13所示，其实时荧光定量PCR下游引物如SequenceNO.14所示。优选地，还含有内参GAPDH的实时荧光定量PCR引物，其实时荧光定量PCR上游引物如SequenceNO.1所示，其实时荧光定量PCR下游引物如SequenceNO.2所示。优选地，还含有实时荧光定量PCR所需要的酶和试剂等。虽然hsa_circ_0068527、hsa_circ_0084169、hsa_circ_0024887单独用于区分肺癌骨转移患者与肺癌未转移患者仅具有一定或较低的准确性，但是hsa_circ_0068527、hsa_circ_0084169、hsa_circ_0024887联合用于区分肺癌骨转移患者与肺癌未转移患者具有较高的准确性，准确率较高。因此，可以基于此制造用于诊断肺癌骨转移的基因检测试剂盒，该试剂盒中含有hsa_circ_0068527、hsa_circ_0084169和hsa_circ_0024887的实时荧光定量PCR引物(如表2)，还含有内参的实时荧光定量PCR引物，以及实时荧光定量PCR所需要的酶和试剂。附图说明图1是hsa-miR-6793-5p单独区分训练集骨转移组与训练集未转移组的ROC曲线。图2是hsa-miR-591单独区分训练集骨转移组与训练集未转移组的ROC曲线。图3是hsa-miR-365a-3p单独区分训练集骨转移组与训练集未转移组的ROC曲线。图4是hsa-miR-6793-5p、hsa-miR-591、hsa-miR-365a-3p联合区分训练集骨转移组与训练集未转移组的ROC曲线。图5是hsa_circ_0068527单独区分训练集骨转移组与训练集未转移组的ROC曲线。图6是hsa_circ_0084169单独区分训练集骨转移组与训练集未转移组的ROC曲线。图7是hsa_circ_0024887单独区分训练集骨转移组与训练集未转移组的ROC曲线。图8是hsa_circ_0068527、hsa_circ_0084169、hsa_circ_0024887联合区分训练集骨转移组与训练集未转移组的ROC曲线。图9是hsa_circ_0068527、hsa-miR-591、hsa-miR-365a-3p联合区分训练集骨转移组与训练集未转移组的ROC曲线。具体实施方式实施例1：基于微小RNA的试剂盒一、实验样本选择2014年6月至2018年6月在四川省肿瘤医院就诊的肺癌患者200例作为研究对象。纳入标准：①预计生存期≥3个月；②血小板＞8×1010/L；③停止放化疗＞1个月；④治疗前停止使用钙剂；排除标准：①严重心、肝、肾疾病；②有其他肿瘤性疾病；③有严重糖尿病；④有免疫系统疾病。根据临床、影像学、病理等确诊为骨转移患者作为骨转移组，未发生骨转移患者作为未转移组。骨转移组88例，未转移组112例。骨转移组中女性42例，年龄36-75岁，平均(52.15±5.25)岁；未转移组中女性58例，年龄38-72岁，平均(54.23±5.16)岁；骨转移组与未转移组性别比例、年龄无显著差异。将骨转移组与未转移组进一步分别随机对半分为如下：训练集骨转移组：44；验证集骨转移组：44；训练集未转移组：56；验证集未转移组：56。二、实验方法1、外周血样品采集及保存选用EDTA抗凝管采集患者清晨空腹外周血5mL，4℃条件下2000r/min离心10min，小心吸取上层清亮血浆液体于无菌冻干管中，标记后放入-80℃冰箱储存备用。2、血浆总RNA提取及质量检测参照TaKaRaRNAisoBlood试剂盒说明书操作，每份样品取血浆250μL，提取血浆样品中的总RNA。应用分光光度计测定总RNA的光密度D(260)和D(280)值，用D(260)值计算其浓度，并计算D(260)/D(280)值检测其纯度，D(260)/D(280)值范围在1.8～2.1认为合格。3、实时荧光定量PCR检测目标微小RNA按PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser试剂盒的说明书进行操作。目标微小RNA和内参GAPDH的实时荧光定量PCR引物由广州锐博生物设计合成，具体见表1。表1实时荧光定量PCR引物2.1去除基因组DNA反应体系为：5×gDNAEraserBuffer2.0μL，gDNAEraser1.0μL，总RNA2μg，RNaseFreedH2O补至10μL。反应条件为：42℃2min，4℃。2.2反转录反应上一步实验的反应液：10.0μL，PrimeScriptRTEnzymeMixⅠ1.0μL，RTPrimerMix1.0μL，5×PrimeScriptBuffer24.0μL，RNaseFreedH2O4.0μL，总共20μL。反应条件为：37℃15min，85℃5s，4℃。2.3RT-PCR反应用AppliedBiosystemsStepous荧光定量PCR测定仪进行反应，按下列组分配制PCR反应液：SYBRPremixExTaqⅡ10μL，PCR上游引物(10μmol/L)0.8μL，PCR下游引物(10μmol/L)0.8μL，ROXReferenceDye0.4μL，RT反应液(cDNA溶液)2.0μL，dH2O(灭菌蒸馏水)6μL，总共20μL。采用两步法PCR反应程序。反应结束后确认PCR的扩增曲线和融解曲线。应用2-ΔΔCt法计算目标微小RNA相对表达量。3、统计学方法数据采用SPSS19.0进行分析。计量资料用均值±偏差表示，采用t检验，计数资料用百分率表示，采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义，并建立ROC曲线，计算曲线下面积(AUC)及95％可信区间。运用Logistic回归筛选变量，建立回归方程，产生一组新变量本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于诊断肺癌患者骨转移的基因检测试剂盒，其特征在于：含有hsa_circ_0068527、hsa_circ_0084169和hsa_circ_0024887的实时荧光定量PCR引物；其中，hsa_circ_0068527的实时荧光定量PCR上游引物如Sequence NO.9所示，其实时荧光定量PCR下游引物如Sequence NO.10所示；hsa_circ_0084169的实时荧光定量PCR上游引物如Sequence NO.11所示，其实时荧光定量PCR下游引物如Sequence NO.12所示；hsa_circ_0024887的实时荧光定量PCR上游引物如Sequence NO.13所示，其实时荧光定量PCR下游引物如Sequence NO.14所示。

【技术特征摘要】
1.一种用于诊断肺癌患者骨转移的基因检测试剂盒，其特征在于：含有hsa_circ_0068527、hsa_circ_0084169和hsa_circ_0024887的实时荧光定量PCR引物；其中，hsa_circ_0068527的实时荧光定量PCR上游引物如SequenceNO.9所示，其实时荧光定量PCR下游引物如SequenceNO.10所示；hsa_circ_0084169的实时荧光定量PCR上游引物如SequenceNO.11所示，其实时荧光定量PCR下游引物如Sequence...

【专利技术属性】
技术研发人员：卢珊珊，
申请(专利权)人：青海七彩花生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：青海,63