一株具有广谱抗病促生作用的解淀粉芽孢杆菌YH-20及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一株具有广谱抗病促生作用的解淀粉芽孢杆菌YH‑20及其应用，该菌株分类命名为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus.amyloliquefaciens)YH‑20，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2018361，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏日期为2018年06月11日。本发明专利技术的解淀粉芽孢杆菌YH‑20对10种植物病原真菌均具有较好的拮抗效果，且对植物本身没有危害，可以明显的促进植物的生长。利用本发明专利技术所提供的解淀粉芽孢杆菌菌株YH‑20可以代替部分农药及化肥的施用。可以有效地保护生态环境以及保护林业树木的生产。

【技术实现步骤摘要】
一株具有广谱抗病促生作用的解淀粉芽孢杆菌YH-20及其应用
本专利技术属于微生物
，具体涉及一株具有广谱抗病促生作用的解淀粉芽孢杆菌YH-20及其应用。
技术介绍
化学防治是林业上防治病虫害的一种重要手段，我国是世界上农药和化肥的使用大国，但是农药和化肥的大量使用造成了环境污染、土壤板结、生态平衡遭到破坏等一系列的问题，随着环境的日益恶化，农药污染问题愈来愈受到人们的重视，所以寻找一种对环境友好且具有良好防治效果的方法则显得尤为重要。生物防治由于具有污染小、专一性强、不易产生抗药性等优点，既对人畜及环境无害，又对近年来受到社会的广泛关注和认可。PGPR是一种可以促进植物生长的根际细菌，其在生长的过程中可以通过释放植物激素、溶磷、固氮或产生抗生素、与病原体竞争生长位点从而达到促生和抗病的效果。目前已有许多PGPR菌株，如芽孢杆菌属、假单胞菌属、沙雷氏菌属和伯克霍尔德氏菌属已在生物防治和促进植物生长中进行应用。这些菌株的应用显著的促进了植物的生长并且减少了植物病害的发生。芽孢杆菌是一种革兰氏阳性菌，作为土壤中的优势菌株，具有生长快、分布广、可以促进植物生长、能够产生的内生孢子、抗逆性强等诸多优点，引起诸多了学者的关注和研究。目前已报道的芽孢杆菌有枯草芽孢杆菌、甲基营养型芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌等等，其中已有部分菌株投入生产，如如美国Gustafson公司开发的枯草芽孢杆菌(B.subtilis)GBO3和短小芽孢杆菌(B.pumilus)GB34、美国NovozymesBiologicals公司开发的地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)SB3086、德国AbitepGmbH公司开发的枯草解淀粉芽孢杆菌(B.subtilisvar.amyloliquefaciens)FZB24等。
技术实现思路
专利技术目的：针对现有技术中存在的不足，本专利技术的目的在于提供一株具有广谱促生作用的解淀粉芽孢杆菌YH-20，满足林业使用需求。本专利技术的另一目的是提供一种上述解淀粉芽孢杆菌YH-20的应用。技术方案：为了实现上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案为：一株具有广谱抗病促生作用的解淀粉芽孢杆菌，分类命名为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus.amyloliquefaciens)YH-20，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M2018361，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏日期为2018年06月11日。本申请的解淀粉芽孢杆菌YH-20，是从上海市嘉定区健康樱花枝干组织中分离鉴定得到的，具体过程如下：菌株的分离：取上海市嘉定区健康樱花枝干组织，先将样品用自来水冲洗干净，晾干后将小枝剪成2cm的小段。然后在超净工作台上进行后续消毒处理(1)75％乙醇溶液浸泡2min(2)用活性氯浓度5.2％的次氯酸钠溶液浸泡枝5-7min、叶20s(3)用无菌水漂洗5次(4)用灭过菌的纱布蘸干水分备用。小枝中内生菌的分离采用组织切片法，表面灭菌后先剪去枝两头变褐的部分，去皮，同时去除木质部，只需保留韧皮部。用灭过菌的镊子将处理好的小枝韧皮部分别置于各类培养基培养，每皿3-4片，用封口膜将培养皿密封，置于培养箱中倒置培养，12h观察一次。若有菌落长出及时分离纯化并编号记录。菌株的筛选：将滤纸片剪成直径5cm的圆形小片灭菌备用，先将过夜摇培的病原细菌(根癌农杆菌(Agrobacteriumtumifaciens)cfcc-1369，保存于南京林业大学森林病理实验室，公众索取可得)均匀的涂布于NA固体培养基，半小时后用小圆片蘸取分离到的菌株的发酵液置于带有病原菌的平板上28℃培养观察。菌株的鉴定：通过培养和观察，发现YH-20细菌菌体均呈杆状，芽孢呈椭圆形或柱状，幼龄菌落为圆形，表面和边缘均光滑，培养15小时后菌落表面变得干燥，起皱，但边缘光滑，菌落仍然为白色，革兰氏染色为阳性，好氧生长。通过菌落形态、16SrDNA序列(序列如SEQIDNO.1所示)分析及生理生化特性可知菌株YH-20为解淀粉芽孢杆菌，分类命名为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus.amyloliquefaciens)YH-20。所述的解淀粉芽抱杆菌YH-20在植物促生中的应用。所述的解淀粉芽抱杆菌YH-20在抑菌中的应用。所述解淀粉芽抱杆菌YH-20的菌剂。所述解淀粉芽抱杆菌YH-20的生物肥料。所述的解淀粉芽抱杆菌YH-20的发酵产物在植物促生中的应用。所述的解淀粉芽抱杆菌YH-20或其发酵产物在防控植物病害中的应用。所述解淀粉芽抱杆菌YH-20在制备菌剂中的应用。所述解淀粉芽抱杆菌YH-20在制备生物肥料中的应用。有益效果：与现有技术相比，本专利技术的解淀粉芽抱杆菌YH-20，对10种植物病原真菌均具有较好的拮抗效果，且对植物本身没有危害，可以明显的促进植物的生长。利用本专利技术所提供的解淀粉芽孢杆菌菌株YH-20可以代替部分农药及化肥的施用。可以有效地保护生态环境以及保护林业树木的生产，具有很好的实用性。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术做进一步的说明。实施例1将解淀粉芽孢杆菌YH-20在LB培养基上划线活化，28℃培养箱培养24h后挑取单菌落于500mLLB液体培养基的1L三角瓶中，180r/min，28℃摇培72h，得到发酵液。将发酵液4℃，10000r/min离心l0min，得上清液，用0.22μm的微孔过滤器进行过滤，即得无菌发酵液。本实例以10种植物病原菌(均保存于南京林业大学森林病理实验室，公众索取可得)为靶标菌，十种植物病原菌分别为：七叶树壳梭孢(Fusicoccusaesculi)、小麦赤霉病菌(Gibberellazeae)、苹果轮纹病菌(Dothierellagregaria)、松树脂溃疡病菌(Fusariumcircinatum)、异角状拟盘多毛孢(Pestalotiopsisvesicolor)、茶云纹叶枯病菌(Guignardiacamelliae)、炭疽菌(Colletotrichumsp)、交链孢(Alternariasp)、松树枯梢病菌(Sphaeropsissapinea)。采用毒介质法测定解淀粉芽孢杆菌YH-20对植物病原菌的抑制率，将20mL的无菌发酵液与冷却至50℃的180mLPDA培养基混匀，倒平板，待冷却后在平板中央接入菌饼(直径5mm)，每个处理三个重复，在28℃培养72h，以加入无菌水作为对照处理，采用十字相差法测量菌落直径，采用菌丝生长速率法计算发酵液的抑菌率，其计算公式为；抑菌率＝(对照菌落直径-处理菌落直径)/(对照菌落直径-菌饼直径)×100％。解淀粉芽孢杆菌YH-20对植物病原菌的抑制结果如表1所示。结果显示解淀粉芽孢杆菌YH-20对植物病原菌的抑菌活性较强，抑菌谱较广。表1解淀粉芽孢杆菌YH-20对供试病原真菌的抑制作用实施例2挑取解淀粉芽孢杆菌YH-20单菌落于500mLLB液体培养基的1L三角瓶中，180r/min，28℃摇培72h，得到发酵液。将发酵液用0.22pm的微孔过滤器进行过滤，得YH-20无菌发酵液，挑选籽粒饱满番茄种子30粒，用YH-20无菌发酵液及其不同稀释倍数(10、50、100、200、500、1000倍)的无菌水稀释液和相同稀释倍数的LB培养液(空白本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株具有广谱抗病促生作用的解淀粉芽孢杆菌，分类命名为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus.amyloliquefaciens)YH‑20，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2018361，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏日期为2018年06月11日。

【技术特征摘要】
1.一株具有广谱抗病促生作用的解淀粉芽孢杆菌，分类命名为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus.amyloliquefaciens)YH-20，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M2018361，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏日期为2018年06月11日。2.权利要求1所述的解淀粉芽抱杆菌YH-20在植物促生中的应用。3.权利要求1所述的解淀粉芽抱杆菌YH-20在抑菌中的应...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶建仁，丁森，王焱，张岳峰，江明明，陆蓝翔，
申请(专利权)人：南京林业大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32