在样本支持物上由生物细胞样本制备蛋白质的方法技术

本发明专利技术涉及在样本支持物上由未纯化生物细胞样本制备蛋白质的方法，以用于质谱分析细胞特性。该所述方法包括以下步骤：在样本支持物的样本点上提供所述生物细胞；使用溶剂和酸中的至少一种破坏样本点上的所述细胞，由此细胞蛋白质与复合物分离，从破坏的细胞中迁移出来并以粘附方式结合至所述样本点；用缓冲溶液洗涤样本点上的细胞蛋白质；以及制备经洗涤的细胞蛋白质以用于随后的解吸电离。所释放的细胞蛋白质附着到样本支持物上，因此可以用缓冲溶液仔细洗涤该细胞蛋白质以除去可能来自早期处理步骤，如来自营养液的盐和其它可溶性杂质，而没有大量的蛋白质因洗脱而无法分析。

Method of Protein Preparation from Biological Cell Samples on Sample Support

The present invention relates to a method for preparing proteins from uncultured biological cell samples on sample support for mass spectrometry analysis of cell characteristics. The method comprises the following steps: providing the biological cell at the sample point of the sample support; destroying the cell at the sample point by using at least one of the solvents and acids, thereby separating the cell protein from the complex, migrating from the destroyed cell and binding to the sample point by adhesion; and buffering. Cell proteins at sample points were washed with solution, and washed cell proteins were prepared for subsequent desorption and ionization. The released cell proteins attach to the sample support, so they can be scrubbed carefully with a buffer solution to remove salts and other soluble impurities that may come from early processing steps, such as nutrient solution, without a large amount of protein being eluted and unable to be analyzed.

【技术实现步骤摘要】
在样本支持物上由生物细胞样本制备蛋白质的方法
本专利技术涉及在质谱样本支持物上由生物细胞制备蛋白质以用于质谱分析细胞特性，例如分类学分类(同一性)、抗生素耐药性，对药物或其它活性物质的响应等。该细胞可以是原核或真核微生物，或来源于组织的真核细胞；特别地可以在样本支持物上在培养基中培养这些细胞，以便能够从它们在某些影响(例如存在特定物质)下的生长中得出关于特定细胞特性的结论。本专利技术提出，通过加入用于随后电离(通过基质辅助激光解吸(MALDI)进行)的基质溶液不会破坏质谱样本支持物上的细胞，但是使用(有机)酸和/或溶剂在单独的处理步骤中破坏细胞。出乎意料的是，从细胞中释放的重质蛋白质随后附着到样本支持物上，因此可以直接用缓冲溶液将重质蛋白质洗涤以去除盐和其它可溶性杂质，而没有大量的蛋白质因洗脱而无法分析。
技术介绍
专利申请PCT/DE2016/100561(K.BeckerandE.Idelevich:“Aufbereitunglebendiger,mikrobiellerProbenundMikroorganismenfüranschlieβendemassenspektrometrischeMessungundAuswertung”(“制备活的微生物样本或微生物以随后进行质谱测量和评估”))详细描述了如何在(例如)添加和不添加抗生素的营养液中孵育质谱样本支持物上的微生物，以便通过观察进一步的生长来确定是否存在耐药性。该文献及其全部内容通过引用并入本文。该文献中描述的方法代表了一种用于非常快速且简单的基于MS的生物细胞特性分析的新方法；该特性例如关于细胞对抗生素或药物的响应或关于生物细胞的进一步表征。本公开尤其涉及样本处理和样本制备的方法以及数据评价算法。所引用的文献的优选方面涉及制备活的微生物样本以进行随后的质谱测量的方法，其包括以下步骤：(a)提供平坦的样本支持物，其含有多个样本施加位置(所谓的“点”)；(b)将培养基液滴中的至少一种活的微生物样本沉积在至少一个样本点上；(c)将样本支持物置于具有确定气氛的孵育室中一段预定的时间，以使微生物生长和繁殖；(d)在预定的一段时间后从培养基液滴中除去残余液体以暴露样本点上的微生物沉积物；(e)制备用于解吸电离的样本点；(f)将样本支持物转移到质谱仪的解吸离子源中，从所制备的样本点中产生离子并采集至少一个相应的质谱；以及(g)将采集的质谱与一组参考数据进行比较，以测定微生物样本的至少一种特性。例如，可以使用该方法来确定存在不同类型的抗生素时微生物细胞的生长：进一步的生长揭示了微生物细胞对所使用的抗生素是否具有耐药性或敏感性。该方法有时会遇到困难。当微生物在液体表面游动(如用沙门氏菌和其他鞭毛虫的情况)时，用该方法将微生物从残余液体中分离，例如用移液管或吸墨纸吸出，可能不会成功，因为那时也有很高的吸出微生物的风险。干燥营养液以将细胞结合到样本支持物表面并随后制备它们留下了营养液中的盐和其他成分，这些盐和其他成分对通过基质辅助激光解吸附进行的电离具有不利影响，并且显著降低许多蛋白质的灵敏度。通常情况下，干燥的微生物样本不能被洗涤，因为许多物种的微生物在营养液干燥后不能牢固地附着到样本支持物的表面。通常，必须破坏生物细胞以测量它们的成分，特别是它们的蛋白质，以便释放蛋白质用于随后的电离。在这种情况下，本文的“破坏”意味着破坏细胞壁并破坏细胞内的蛋白质复合物，使得蛋白质可以从细胞中迁移出来。建议两种破坏方法：(1)通过借助特殊容器中的酸使经洗涤的微生物离心来进行“外部”破坏，进一步离心并将具有来自细胞的蛋白质的上清液转移到质谱样本支持物上，(2)通过添加基质物质的溶液(即，有机溶剂中的有机酸)来破坏施加至样本支持物的细胞，该有机酸使大部分微生物破坏。同时基质溶液制备样本以随后进行基质辅助激光解吸(MALDI)电离。在用于鉴定微生物的方法中，外部破坏提供了更高比例的明确鉴定，但由于需要多次离心，因此外部破坏需要明显更长的时间，并且工作量更大。在论文“EvaluationofaSimpleProteinExtractionMethodforSpeciesIdentificationofClinicallyRelevantStaphylococcibyMatrix-AssistedLaserDesorptionIonization–TimeofFlightMassSpectrometry(通过基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱评价用于临床相关葡萄球菌的物种鉴定的简单的蛋白质提取方法)(N.Matsudaetal.,J.Clin.Microbiology,50,3862-3866,2012)”中，除了所述的两种方法之外，还研究了用70％甲酸对样本支持板上的微生物破坏，其具有与外部破坏类似的良好结果，但需要大量的时间和工作。在出版物“EvaluationofaShort,On-PlateFormicAcidExtractionMethodforMatrix-AssistedLaserDesorptionIonization–TimeofFlightMassSpectrometry-BasedIdentificationofClinicallyRelevantYeastIsolates(用于基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱鉴定临床相关酵母菌株的短的板上甲酸提取方法的评价)(R.L.Gortonetal.,J.Clin.Microbiology52,1253-1255,2014)”中，同样研究了样本支持物上的细胞破坏，但这些是酵母细胞，鉴定的成功率明显低于外部破坏。在这两份公开文献中，样本都是在样本支持物上破坏后直接进行干燥，并用MALDI电离用的基质溶液进行制备。特别是盐或其它可溶性杂质未被除去：施加的生物细胞对于MALDI制备显然应当总是足够清洁的。因此仍然需要一种方法，该方法允许质谱样本支持物上(例如在样本支持物本身上的营养液滴中孵育之后)的被盐和其它可溶性杂质污染的细胞以这样的方式准备，即，解吸电离的灵敏度(例如在MALDI的帮助下)几乎完全保留。
技术实现思路
本专利技术现在提出，质谱样本支持物的样本点上的生物细胞不是被添加的基质溶液破坏，而是通过使用无基质(有机)酸和/或溶剂在单独处理步骤破坏。出人意料地是，通过这种破坏释放的细胞蛋白质良好地附着到样本支持物的表面并且可以用洗涤缓冲液(例如纯水)洗涤以除去可能来自早期处理步骤的盐、洗涤剂、缓冲物质和其它可溶性杂质。根据第一方面，本专利技术涉及由样本支持物上的未纯化生物细胞样本(例如微生物)制备蛋白质的方法，以用于质谱测定细胞特性，例如微生物分类学的分类或其对抗菌物质的耐药性，该方法包括以下步骤：-在样本支持物的样本点上提供生物细胞，该样本支持物可以包括不锈钢板、在疏水环境中具有亲水锚定物的板(“AnchorChipTM”)、或被覆陶瓷材料的板，-借助(有机)酸和/或溶剂破坏样本点上的细胞，使得细胞蛋白质与复合物分离，从破坏的细胞中迁移出来并以粘附方式结合至所述样本点，-用(静态)缓冲溶液洗涤样本点上的细胞蛋白质，例如通过将几微升水溶液(特别是纯去离子水)施加到样本点上，在该处保留预定的一段时间，然后将其去除，以及-制本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种在样本支持物上由未纯化生物细胞样本制备蛋白质的方法，该蛋白质用于质谱测定细胞特性，所述方法包括以下步骤：‑在所述样本支持物的样本点上提供所述生物细胞，‑使用溶剂和酸中的至少一种破坏所述样本点上的所述细胞，由此细胞蛋白质与复合物分离，从破坏的细胞中迁移出来并以粘附方式结合至所述样本点，‑用缓冲溶液洗涤所述样本点上的所述细胞蛋白质，以及‑制备经洗涤的细胞蛋白质以用于随后的解吸电离。

【技术特征摘要】
2017.05.15 DE 102017110476.31.一种在样本支持物上由未纯化生物细胞样本制备蛋白质的方法，该蛋白质用于质谱测定细胞特性，所述方法包括以下步骤：-在所述样本支持物的样本点上提供所述生物细胞，-使用溶剂和酸中的至少一种破坏所述样本点上的所述细胞，由此细胞蛋白质与复合物分离，从破坏的细胞中迁移出来并以粘附方式结合至所述样本点，-用缓冲溶液洗涤所述样本点上的所述细胞蛋白质，以及-制备经洗涤的细胞蛋白质以用于随后的解吸电离。2.根据权利要求1所述的方法，其中使用静态缓冲溶液来进行洗涤步骤。3.根据权利要求2所述的方法，其中，对于洗涤步骤，将几微升的水溶液施加到所述样本点上，在该处保持预定的一段时间，然后将其去除。4.根据权利要求1所述的方法，其中用于解吸电离的制备步骤包括：在所述样本点上添加基质溶液并且结晶，以随后进行基质辅助激光解吸电离。5.根据权利要求1所述的方法，其中质谱样本支持物包括不锈钢板、在疏水环境中具有亲水锚定物的板(“AnchorChipTM”)、以及由被覆陶瓷材料制成的板中的一者。6.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物细胞包括微生物。7.根据权利要求6所述的方法，其中提供所述生物细胞包括下列中的一者：(i)直接在质谱样本支持物的样本点上...

【专利技术属性】
技术研发人员：卡特里·斯帕比尔，贝娅特丽克丝·韦格曼，
申请(专利权)人：布鲁克道尔顿有限公司，
类型：发明
国别省市：德国,DE