用于欧鳇苗种鉴定的生物传感检测方法技术

本发明专利技术公开了一种用于欧鳇苗种鉴定的生物传感检测方法，以待测苗种的DNA为模板进行探针延伸获得探针延伸产物，应用生物传感检测方法检测所述探针延伸产物是否能够通过锚定标记分子锚定至修饰有锚定受体的电极表面并产生电化学信号，若是，则待测苗种为欧鳇苗种，其中，包括以下步骤：在探针延伸中，将带有锚定标记分子的dUTP连接至如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列的探针上以获得所述待测苗种中欧鳇苗种的探针延伸产物。本发明专利技术方法能够在鲟鱼苗种引进时鉴定其物种来源，协助养殖机构开展养殖对象和加工产品分级。

【技术实现步骤摘要】
用于欧鳇苗种鉴定的生物传感检测方法
本专利技术涉及水产生物
，特别涉及一种用于欧鳇苗种鉴定的生物传感检测方法。
技术介绍
鲟鱼是鲟形目(Acipenseriformes)鱼类的统称，全世界现存2科6属27种，已全部列入《濒危野生动植物种国际贸易公约》(CITES)保护物种名录，当前合法销售的鲟鱼及其制品主要依赖人工养殖。在这一背景下，我国鲟鱼养殖产业蓬勃发展，年产量从2003年的0.94万吨增长至2016年的8.98万吨，稳居世界第一鲟鱼养殖大国，占世界总产量的80％以上。2017年起，鲟鱼被列入国家现代农业产业技术体系(特色淡水鱼体系)中。鲟鱼是水产养殖物种中典型的高附加值品类，其鱼卵加工而成的鱼子酱是国际公认的高端食材，具有深厚的历史积淀和文化传承。鱼子酱饮食文化中对鱼卵的种质来源有着严格的限定，不同物种的鱼子酱价格差异巨大，使用欧鳇鱼卵加工而成的Beluga鱼子酱为其中的极品，价比黄金。但目前人工养殖的鲟鱼品类繁多，不仅包括鲟形目的多个物种，还涉及多个人工育成的杂交品种，外形相似度较高，很多养殖机构和人员并不清楚养殖对象的遗传背景。目前进行鲟鱼物种鉴定主要采用的方法包括形态学和分子生物学方法。形态学方法不适用于受精卵和小规格苗种，无法在苗种引进阶段准确鉴定物种，而以物种特异性DNA序列为检测靶标的方法则不受发育时期、样本形态、组织来源的影响，并能够形成易于标准化的检测体系，在物种鉴定技术中逐渐占据了主流地位。Congiu等使用AFLP分子标记方法进行了鲟鱼及鱼子酱产品的鉴别应用，Chelomina等使用RAPD分子标记进行施氏鲟(Acipenserschrenckii)自然种群中杂交种鉴别分析，董传举等开发了基于线粒体DNA的PCR-RFLP分子鉴定方法，但现有方法均需要通过电泳操作来检测产物，操作不当时对检测人员存在健康风险，未经安全处理的实验废弃物也可能造成环境污染隐患，因此只适用于专业实验室，不适用于现场检测。因此，亟待开发准确便捷的现场检测技术，用于苗种引进时鉴定其物种来源，协助养殖机构开展养殖对象和加工产品分级。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。本专利技术还有一个目的是提供一种用于欧鳇苗种鉴定的生物传感检测方法，其能够通过对鲟鱼的待测苗种进行检测，以在欧鳇引进时鉴定其物种来源，协助养殖机构开展养殖对象和加工产品分级。为了实现根据本专利技术的这些目的和其它优点，提供了一种用于欧鳇苗种鉴定的生物传感检测方法，以待测苗种的DNA为模板进行探针延伸获得探针延伸产物，应用生物传感检测方法检测所述探针延伸产物是否能够通过锚定标记分子锚定至修饰有锚定受体的电极表面并产生电化学信号，若是，则待测苗种为欧鳇苗种，其中，包括以下步骤：在探针延伸中，将带有锚定标记分子的dUTP连接至如SEQIDNO:3所示的核苷酸序列的探针上以获得所述待测苗种中欧鳇苗种的探针延伸产物。优选的是，还包括以下步骤：在探针延伸之前，向提取的待测苗种的DNA中依次加入带有锚定标记分子的dUTP、dATP、dTTP、DNA聚合酶、缓冲液和如SEQIDNO:3所示的核苷酸序列作为欧鳇特异性单链DNA探针构建探针延伸反应体系。优选的是，所述步骤一还包括以下步骤：提取待测苗种的DNA，以如SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示的核苷酸序列作为特异性引物进行PCR扩增，纯化PCR产物；向所述纯化PCR产物中加入dATP、dTTP、带有锚定标记分子的dUTP、DNA聚合酶、缓冲液和如SEQIDNO:3所示的核苷酸序列作为欧鳇特异性单链DNA探针构建探针延伸反应体系并进行探针延伸。优选的是，所述步骤一还包括以下步骤：向所述纯化PCR产物中加入dATP、dTTP、带有锚定标记分子的dUTP、DNA聚合酶及其缓冲液，之后分为均等的两份；其中一份中加入如SEQIDNO:3所示的核苷酸序列作为欧鳇特异性单链DNA探针以构建探针延伸反应体系并进行探针延伸获得探针延伸产物Ⅰ；另一份中加入如SEQIDNO:4所示的核苷酸序列作为鲟属通用性单链DNA探针以构建探针延伸反应体系并进行探针延伸获得探针延伸产物Ⅱ；所述步骤二还包括：将所述探针延伸产物Ⅰ和所述探针延伸产物Ⅱ分别滴加于两支修饰有锚定受体的电极表面进行锚定反应，检测所述电极表面是否存在所述电化学活性标记分子的电化学信号，若两支修饰有锚定受体的电极表面均能够检测到所述电化学标记分子的电化学信号，表明所述待测苗种为具有欧鳇血统的杂交鲟；若滴加所述探针延伸产物Ⅰ的电极表面未检测到所述电化学标记分子的电化学信号，滴加所述探针延伸产物Ⅱ的电极表面检测到所述电化学标记分子的电化学信号，表明所述待测苗种为除欧鳇之外的其他鲟鱼。优选的是，若两支修饰有锚定受体的电极表面均未检测到所述电化学标记分子的电化学信号，则探针延伸反应体系异常，检测失败。优选的是，所述的用于鲑鳟鱼苗种鉴定的生物传感检测方法中，所述的电化学活性标记分子为二茂铁及其衍生物、铁氰化钾、硫堇、邻苯二酚、对苯二酚、稀土单酞菁、铱氯水配合物、血红蛋白和肌红蛋白中的任意一种。优选的是，所述锚定分子为生物素、亲和素、抗原、抗体、抗抗体、细胞因子、受体和核酸适配体中的任意一种。优选的是，所述的电化学信号为差分脉冲伏安信号、循环伏安信号或交流阻抗信号。优选的是，所述PCR扩增的反应条件为94℃预变性5min，然后94℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸30s，从预热、退火到延伸重复25个循环，然后72℃延伸5min，94℃变性5min，迅速降温至4℃。优选的是，dATP、dTTP、dUTP物质的量比为2:1:1；其中，所述的DNA聚合酶为BstDNA聚合酶时，探针延伸的反应温度为60-65℃，反应时间为1-3min；所述DNA聚合酶为高保真TaqDNA聚合酶时，探针延伸反应温度60-70℃，反应时间为1-3min。优选的是，所述的锚定标记分子为生物素，所述的锚定受体为亲和素或链霉亲和素，锚定反应温度为37℃，锚定反应时间为10-30min。优选的是，将探针延伸后的探针延伸产物滴加于修饰有锚定受体的电极表面进行锚定反应，然后洗脱电极表面未结合的反应液成分；其中，洗脱条件为使用pH7.0的Tris-EDTA缓冲液洗脱3次，每次洗脱2-5min。本专利技术至少包括以下有益效果：一种准确便捷的欧鳇物种鉴定技术，适用于处在生活史任何阶段、任意形态的鱼类样本，包括鱼卵、鱼苗、成鱼，以及DNA未完全降解的各种组织和制品。本专利技术中PCR扩增靶标为待测苗种的核基因组内的血红蛋白基因，规避了常规物种鉴定技术中靶序列来源于线粒体基因组的母系遗传特征，能够避免人工养殖中杂交制种对检测结果的误导。本专利技术基于电化学生物传感检测原理，易于数字化和集成化，可在其基础上构建芯片进行高通量多位点快速检测。本专利技术不使用任何有毒有害试剂，检测操作全程不存在人身健康或环境污染隐患。本专利技术的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本专利技术的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。附图说明图1为本专利技术中引物和探针的基因组位置比对图，所示序列自上而下依次为俄罗斯鲟(Acipensergueldenstaedtii)、裸腹鲟(Acipensernu本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于欧鳇苗种鉴定的生物传感检测方法，以待测苗种的DNA为模板进行探针延伸获得探针延伸产物，应用生物传感检测方法检测所述探针延伸产物是否能够通过锚定标记分子锚定至修饰有锚定受体的电极表面并产生电化学信号，若是，则待测苗种为欧鳇苗种，其中，包括以下步骤：在探针延伸中，将带有锚定标记分子的dUTP连接至如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列的探针上以获得所述待测苗种中欧鳇苗种的探针延伸产物。

【技术特征摘要】
1.一种用于欧鳇苗种鉴定的生物传感检测方法，以待测苗种的DNA为模板进行探针延伸获得探针延伸产物，应用生物传感检测方法检测所述探针延伸产物是否能够通过锚定标记分子锚定至修饰有锚定受体的电极表面并产生电化学信号，若是，则待测苗种为欧鳇苗种，其中，包括以下步骤：在探针延伸中，将带有锚定标记分子的dUTP连接至如SEQIDNO:3所示的核苷酸序列的探针上以获得所述待测苗种中欧鳇苗种的探针延伸产物。2.如权利要求1所述的用于欧鳇苗种鉴定的生物传感检测方法，其特征在于，还包括以下步骤：在探针延伸之前，向提取的待测苗种的DNA中依次加入带有锚定标记分子的dUTP、dATP、dTTP、DNA聚合酶、缓冲液和如SEQIDNO:3所示的核苷酸序列作为欧鳇特异性单链DNA探针构建探针延伸反应体系。3.如权利要求2所述的用于欧鳇苗种鉴定的生物传感检测方法，其特征在于，还包括以下步骤：提取待测苗种的DNA，以如SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示的核苷酸序列作为特异性引物进行PCR扩增，纯化PCR产物；向所述纯化PCR产物中加入dATP、dTTP、带有锚定标记分子的dUTP、DNA聚合酶、缓冲液和如SEQIDNO:3所示的核苷酸序列作为欧鳇特异性单链DNA探针构建探针延伸反应体系并进行探针延伸。4.如权利要求3所述的用于欧鳇苗种鉴定的生物传感检测方法，其特征在于，还包括以下步骤：向所述纯化PCR产物中加入dATP、dTTP、带有锚定标记分子的dUTP、DNA聚合酶及其缓冲液，之后分为均等的两份；其中一份中加入如SEQIDNO:3所示的核苷酸序列作为欧鳇特异性单链DNA探针以构建探针延伸反应体系并进行探针延伸获得探针延伸产物Ⅰ；另一份中加入如SEQIDNO:4所示的核苷酸序列作为鲟属通用性单链DNA探针以构建探针延伸反应体系并进行探针延伸获得探针延伸产物Ⅱ；将所述探针延伸产物Ⅰ和所述探针延伸产物Ⅱ分别滴加于两支修饰有锚定受体的电极表面进行锚定反应，检测所述电极表面是否存在所述电化学活性标记分子的电化学信号，若两支修饰有锚定受体的电极表面均能够检测到所述电化学标记分子的电化学信号，表明所述待测苗种为具有欧鳇血统的杂交鲟；若滴...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵紫霞，江炎亮，许建，张研，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院，
类型：发明
国别省市：北京,11