一种新型木聚糖酶制造技术

本发明专利技术涉及基因工程领域，具体地，本发明专利技术涉及一种新型木聚糖酶Xyn‑dx及其应用。本发明专利技术的新型木聚糖酶Xyn‑dx，其具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，上述木聚糖酶，其具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。本发明专利技术的木聚糖酶具有以下性质：最适pH8.5，最适温度70℃，良好的pH稳定性和热稳定性。其做为一种新型的酶制剂，可广泛用于造纸以及饲料添加剂等。

【技术实现步骤摘要】
一种新型木聚糖酶
本专利技术涉及基因工程领域，具体涉及一种木聚糖酶编码基因及其应用。
技术介绍
木聚糖是一种多聚五碳糖，也是半纤维素的重要的组成成分。它在自然界中含量仅次于纤维素的第二丰富的多聚糖，几乎占地球可更新有机碳含量的三分之一。木聚糖广泛存在于植物的树皮、果实、木质、根、叶等，是自然界中最重要的可再生资源。木聚糖酶是可将木聚糖降解成低聚糖和木糖的一类酶的总称。对木聚糖酶的研究主要集中在适合于制浆造纸工业、食品工业、能源工业等方面的木聚糖酶，已经从不同来源的微生物中分离到大量的不同类型不同功能的木聚糖酶。并分离出多种木聚糖酶基因，已工业化生产多种木聚糖酶产品。近年来，随着人们对畜产品品质安全卫生的要求，开发使用高品质无毒、无害和无污染残留的绿色饲料添加剂已成为我国饲料工业面临的一个紧迫问题。中国饲料产量位居世界第二，然而饲料资源并不丰富，其中能量饲料缺口较大，据预测在2010～2020年将达0.43亿吨。规模化养殖的发展，使充分利用非常规饲料资源成为畜牧业长期、持续和健康发展的关键。我国长期以玉米为主要能量饲料原料的现状造成玉米供应日趋紧张，因此必须充分地开发利用资源丰富的麦类、谷物和糠麸。但麦类、谷物和糠麸等副产品中都存在抗营养因子—木聚糖，限制了其在饲料中的大量应用。随着生物技术的发展，饲用酶制剂和微生物制剂的产量得到了快速增长，质量也有了显著提高，酶制剂可以提高饲料利用率、促进动物生长、改善生态环境和防治动物疾病，避免了由于添加抗生素、激素和高铜等物质所产生的负面影响，具有明显的经济效益和积极的环保意义。我国饲料行业，在配合饲料中除一般玉米-豆粕型日粮，实际上更多的情况是在玉米-豆粕型日粮基础上可能加人10％-40％的大麦或小麦、次粉、麦麸、统糠、棉粕等非常规饲用原料，这使得木聚糖酶在饲料工业中占有重要地位。另外，中国已加人WTO，国外低价格小麦、大麦产品的涌人，将进一步刺激木聚糖酶的市场需求。添加以木聚糖酶为主的饲用酶制剂，消除抗营养因子的抗营养作用，市场前景极为广阔。除此之外，国内外的科学家开始对木聚糖酶在纸浆和造纸工业上的应用进行了大量的研究。主要原因是用木聚糖酶对纸浆进行预处理后，可大大减少后续漂白过程中氯化物的用量，从而降低纸浆和造纸工业对环境造成的污染。因此，获得新型具有优良特性木聚糖酶的研究仍具有重大意义。克隆和分离具有耐高温和较广的pH稳定性的木聚糖酶可以更好的应用于造纸工业、饲料和食品，而且可以降低生产成本，都是木聚糖酶应用于工业化生产所必需的。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的主要目的在于提供一种木聚糖酶编码基因Xyn-dx，木聚糖酶及其应用，所述木聚糖酶耐高温且具有较广泛的pH稳定性。本专利技术所提供的木聚糖酶编码基因Xyn-dx可为如下1)-3)中任一所述的基因：1)其核苷酸序列是序列表中的SEQNo.1；2)在严格条件下可与序列表中SEQNo.1限定的DNA序列杂交且编码木聚糖酶的DNA分子；3)与1)的基因具有90％以上的同源性，且编码木聚糖酶的DNA分子。本专利技术的另一个目的是提供包含上述木聚糖酶的重组载体。本专利技术的另一个目的是提供包含上述木聚糖酶基因的重组菌株。本专利技术的另一个目的是提供上述木聚糖酶的应用。本专利技术的另一个目的是提供一种木聚糖酶的发酵方法。附图说明图1为木聚糖酶的最适反应pH；图2为木聚糖酶的最适反应温度；图3为木聚糖酶的热稳定性图4为木聚糖酶的pH稳定性。具体实施方式下面通过具体实施例，对本专利技术的技术方案作进一步的具体说明。应当理解，本专利技术的实施并不局限于下面的实施例，对本专利技术所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本专利技术保护范围。在本专利技术中，若非特指，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。实施例1、Xyn-dx基因的克隆及重组质粒pET-30a/Xyn-dx的构建Xyn-dx木聚糖酶基因的克隆方法如下：①设计含有EcoRI和XhoI两个限制性酶切位点的引物:LXY-F：5′CCGGAATTCATGCGCCCCGTAGACTAT3′，核苷酸序列如SEQIDNo.3所示，LXY-R：5′CCGCTCGAGGATCATTCTTATTCTAAA3′，核苷酸序列如SEQIDNo.4所示。②PCR扩增预先准备好的Xyn-dx基因的阳性质粒(该质粒上携带的Xyn-dx是在牛的瘤胃中的微生物群构建文库通过筛选获得)，Xyn-dx基因的扩增条件如下：94℃预变性2min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸45s，共30个循环；第30个循环72℃延伸10min，PCR产物用凝胶电泳鉴定后，切胶回收使用或存于-20℃备用。③使用EcoRI和XhoI对目的基因PCR片段与pET-30a载体双酶切。37℃酶切1h。酶切结束后清洗回收。④目的基因与pET-30a载体连接20μl体系，10μl回收的目的基因与2μl回收表达载体，使用T4连接酶4℃过夜连接。实施例2、重组质粒在大肠杆菌中的表达热激转化取10μl连接产物与大肠杆菌感受态BL21(DE3)小心混匀，冰浴30min；42℃水浴热激60s，立即取出冰浴2-3min；加入900μl37℃预热的SOC溶液，150rpm恒温培养1h；吸取50μl转化后的菌液，涂布于含卡那霉素筛选培养基中，37℃恒温培养15h；挑取菌斑进行菌液PCR鉴定，确认为阳性的克隆子转接到含卡那霉素的LB液体培养基中扩大培养。实施例3、阳性菌株的诱导、纯化①阳性菌株的诱导吸取10μl阳性菌液转接至5mL含卡那霉素(100μg/mL)的LB液体培养基中，37℃，220rpm培养16h。将5mL菌液转接至100mLLB液体培养基中，37℃，220rpm继续培养至OD＝0.8(大约8小时)。加入100μlIPTG(终浓度1mmol/L)，25℃，150rpm低温诱导培养12h。将诱导表达的菌液转移至50mL离心管中，12000rpm，4℃离心15min，弃掉上清，加入20mLPBS缓冲液(pH7.4)充分重悬菌体。放入至盛有冰块的烧杯中，超声波反复破碎2次(每次超声15min，工作时间3s，间歇时间5s，6号变幅杆，破碎功率195W)。破碎菌液12000rpm，4℃离心15min，所得上清为粗蛋白液，立即使用或4℃保存。②目的蛋白亲和层析取20mL上步所获得的粗蛋白液，加入400μl的1mol/L咪唑(终浓度为15mmol/L)，充分混匀后，加入Ni-NTA树脂填料700mL，水平放置于冰上缓慢振荡1h，使镍离子与目的蛋白上的6×His标签充分结合。将粗蛋白与Ni-NTA树脂混合液转移到层析柱子，反复上柱收集穿透液。待混合蛋白样液液面接近Ni-NTA树脂填料时，用20倍柱床体积(20mL)的Washingbuffer1(含20mmol/L咪唑)洗涤柱子，除去杂蛋白，用1.5mL离心管收集清洗液。用2倍柱床体积(2mL)的washingbuffer2(含50mmol/L咪唑)涤柱子，用1.5mL离心管收集清洗液。Washingbuffer洗涤后，用1个柱床体积(1mL)的Elutionbuffer(含250mmol/L咪唑)洗脱目的蛋白，洗脱4次，用1.5mL离心管收集洗脱液本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种新型木聚糖酶Xyn‑dx，其特征在于：所述新型木聚糖酶编码基因可为如下1)‑3)中任一所述的基因：1)其核苷酸序列是序列表中的SEQ No.1；2)在严格条件下可与序列表中SEQ No.1限定的DNA序列杂交且编码木聚糖酶的DNA分子；3)与1)的基因具有95％以上的同源性，且编码木聚糖酶的DNA分子。

【技术特征摘要】
1.一种新型木聚糖酶Xyn-dx，其特征在于：所述新型木聚糖酶编码基因可为如下1)-3)中任一所述的基因：1)其核苷酸序列是序列表中的SEQNo.1；2)在严格条件下可与序列表中SEQNo.1限定的DNA序列杂交且编码木聚糖酶的DNA分子；3)与1)的基因具有95％以上的同源性，且编码木聚糖酶的DNA分子。2.一种新型木聚糖酶Xyn-dx，其特征在于：所述新型木聚糖酶的蛋白...

【专利技术属性】
技术研发人员：不公告发明人，
申请(专利权)人：邵玉芹，
类型：发明
国别省市：浙江,33