一种热稳定性提高的新琼二糖水解酶制造技术

本发明专利技术的目的是提供一种热稳定性提高的新琼二糖水解酶，该新琼二糖水解酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:3。本发明专利技术所提供的热稳定性提高的新琼二糖水解酶，相比较原始酶而言，该突变子的最适温度提高了3℃，半衰温度提高了2.5℃，半衰期t1/2也有了显著提高，其热稳定性显著增强，在40℃保温40min仍然能够水解底物新琼二糖，且该突变子的酶活较原始酶提高了约15％。

A new thermostable two glucose hydrolytic enzyme

The aim of the present invention is to provide a new agarose hydrolase with improved thermal stability. The amino acid sequence of the new agarose hydrolase is SEQ ID NO:3. Compared with the original enzyme, the optimum temperature, half-life temperature and half-life t1/2 of the mutant are increased by 3 C, 2.5 C and 2.5 C. The thermal stability of the new agarose hydrolase is significantly enhanced. The substrate can still hydrolyze the new agarose at 40 C for 40 min. The enzyme activity of mutants increased by about 15% compared with the original enzyme.

【技术实现步骤摘要】
一种热稳定性提高的新琼二糖水解酶
本专利技术属于酶改造
，具体涉及一种热稳定性提高的新琼二糖水解酶。
技术介绍
新琼二糖水解酶是一类能够水解新琼二糖或新琼寡糖生成单糖和琼寡糖的酶，对微生物的新陈代谢具有重要意义。其水解产物3,6-内醚-L-半乳糖(L-AHG)生理活性多样，在医药、生物领域都有巨大的应用价值。研究表明，在许多领域，奇数型琼寡糖的性质显著优于新琼寡糖，因此对新琼二糖水解酶的研究打破了目前琼寡糖无法工业化生产的困境。温度是酶催化反应中的重要影响因素，在一定范围内随着温度的升高反应速率加快，但过高的温度会降低酶的活性甚至使酶失活。酶的热稳定性是指酶经过一定温度的孵育还能保存的酶活性。虽然自然界中存在嗜热菌，但数量极少，无法实现工业上的要求。提高酶的热稳定性可以使酶的作用环境更加广泛、延长酶反应的时间、降低成本，在工业上具有良好的应用前景。新琼二糖水解酶AgWH117A是参与琼脂代谢的关键酶，保证了微生物对新琼二糖的降解利用，其能够降解新琼寡糖生成内醚半乳糖和奇数琼寡糖的性质也具有极大的工业价值。但在使用过程中发现，对该酶进行固定化时存在热稳定性差的问题。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种热稳定性提高的新琼二糖水解酶，该新琼二糖水解酶相比于未改造的蛋白酶具有更好的热稳定性。本专利技术所提供的热稳定性提高的新琼二糖水解酶，是氨基酸序列为SEQIDNO:1的蛋白酶的第134位由K变为D；所述的氨基酸序列为SEQIDNO:1的蛋白酶，其编码基因的核苷酸序列为SEQIDNO:2；本专利技术所提供的热稳定性提高的新琼二糖水解酶,其氨基酸序列为SEQIDNO:3；编码本专利技术新琼二糖水解酶的基因，其一种核苷酸序列为SEQIDNO:4。本专利技术还提供一种重组表达载体，用于表达氨基酸序列为SEQIDNO:3的新琼二糖水解酶。本专利技术的氨基酸序列为SEQIDNO:3的新琼二糖水解酶用于降解新琼2糖来制备3,6-内醚-L-半乳糖(L-AHG)。本专利技术所提供的热稳定性提高的新琼二糖水解酶，相比较原始酶而言，该突变子的最适温度提高了3℃，半衰温度提高了2.5℃，半衰期t1/2也有了显著提高，其热稳定性显著增强，在40℃保温40min仍然能够水解底物新琼二糖，且该突变子的酶活较原始酶提高了约15％。附图说明图1：各待筛选突变体位点的热稳定性结果图；图2：K134D和原始酶的热稳定性曲线图；图3：K134D和原始酶不同温度下酶失活实验结果图；图4：AgWH117原始酶A和突变体K134D最适温度曲线图；图5：AgWH117原始酶A和突变体K134D最适pH曲线图。具体实施方式新琼二糖水解酶AgWH117A(氨基酸序列为SEQIDNO:1，一种编码基因的核苷酸序列为SEQIDNO:2)是参与琼脂代谢的关键酶，保证了微生物对新琼二糖的降解利用，其能够降解新琼寡糖生成内醚半乳糖和奇数琼寡糖的性质也具有极大的工业价值。本专利技术对AgWH117A进行了定点饱和突变，筛选获得了热稳定性显著提高的酶。本专利技术所使用的材料及试剂如下：Luria-Bertani(LB)培养基：酵母提取物5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，去离子水溶解后，在121℃下高压灭菌20min。相应的固体培养基的制作方法为在上述液体培养基中加入约1.5％的琼脂粉，经121℃高压灭菌20min。待培养基温度降至50℃左右加入氨苄青霉素，浓度为100mg/L。然后将其倒入已经过灭菌的的培养皿中，确认其冷却凝固后使用。琼脂糖均购买自美国Sigma公司。氨苄青霉素和异丙基-P-D-硫代半乳糖苷(IPTG)购买自上海生工生物工程有限公司。蛋白胨和酵母提取物购买自OXOID公司。引物合成由上海生工生物工程有限公司完成。所有测序服务为华大基因公司提供。其他常规试剂均为国产分析纯。大肠杆菌质粒小提试剂盒、考马斯亮蓝染液和Branford蛋白浓度定量试剂盒购买自北京天根生化科技有限公司。QuickChangeLightningSite-DierectedMutagenesisKits试剂盒购买自Stratagene公司(安捷伦)，用于点突变实验。消化酶DpnI购买自ThermoScientific公司。用于蛋白变性凝胶电泳SDS-PAGE的相应试剂购买自上海捷瑞生物科技有限公司。DNAMarker和ProteinMarker购买自Takara公司。所使用的检测方法如下：1)酶活检测标准反应条件为：20mM，pH6.0的柠檬酸钠缓冲液(包含有0.1％(w/v)新琼二糖作为反应底物)99μL，酶液1μL，30℃水浴10min，然后加热煮沸2min用以终止整个反应。采用高效液相色谱(HPLC)检测底物减少量，最终确定酶活。新琼二糖水解酶的酶活定义如下：在标准反应条件下，每分钟水解1μM新琼二糖所需要的酶量定义为1个单位(U)酶活。2)酶学性质检测酶的最适温度考量通过检测酶液在不同温度(25-50℃)下的酶活以确定。最适pH的检测则通过更换不同pH的缓冲液(pH4.0-10.0)，分别检测其酶活以确定最适pH。酶的热稳定性检测条件为将酶液保存在不同温度(25-50℃)下，每隔10min(10、20、30、40min)取样在标准反应条件下检测酶的残余酶活。3)新琼二糖含量新琼二糖含量检测的HPLC条件为：采用WatersSugar-PakI柱(300×6.5mm，Waters，Milford)，流动相为50mg/LEDTA钙水溶液，流速0.5mL/min，柱温控制在65℃，检测器是视差检测器。下面结合实施例对本专利技术进行详细的描述。实施例1：热稳定性提高的新琼二糖水解酶的筛选1、AgWH117A酶蛋白突变蛋白的筛选通过分析AgWH117A酶蛋白中各个氨基酸的电荷分布引起的吉布斯自由能变化ΔGqq，从而衡量氨基酸的电荷分布对酶稳定性的影响。通过计算AgWH117A酶蛋白中各个氨基酸的ΔGqq，排除自由能较小的氨基酸位点。同时考虑到活性位点的氨基酸改变有极大可能性引起失活，因此也排除活性位点氨基酸。再者处于Loop环上的氨基酸对蛋白质折叠起关键作用，所以回避Loop环上的氨基酸。最终将剩下的氨基酸位点进行丙氨酸扫描以确定点定点饱和突变的氨基酸残基位点(表1)。表1：部分选定的氨基酸突变位点最后选取的氨基酸位点为56Lys、61Tyr、62His、94His、134Lys、136Tyr、139Tyr、201His、216Tyr、218Tyr、268His。对这些位点进行丙氨酸扫描实验，将其分别突变成为丙氨酸Ala并检测各个突变子在40℃下的热稳定性。结果表明，AgWH117A原始酶和各突变子在40℃水浴中保温20min，通过比较原始酶和突变,的热稳定性可见，除Y261突变为丙氨酸后出现酶活消失的情况外，其余突变子都仍然保留有降解新琼二糖的能力。但是总体而言，突变子的酶活都有着不同程度的变化。除K134A突变子外，其他突变子的酶活都降低了，而且半数以上下降程度十分明显。突变子K134A初始酶活提高了约4％，并且保温20min后，仍保留有约24％的初始酶活，总体而言热稳定性也有着轻微幅度的提高。而这里值得注意的是突变子Y61A，虽然它的初始酶活只有原始酶的69％，但是在40℃保温20min后，其本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种热稳定性提高的新琼二糖水解酶，其特征在于，所述的新琼二糖水解酶使氨基酸序列为SEQ ID NO:1的蛋白酶的第134位由K变为D。

【技术特征摘要】
1.一种热稳定性提高的新琼二糖水解酶，其特征在于，所述的新琼二糖水解酶使氨基酸序列为SEQIDNO:1的蛋白酶的第134位由K变为D。2.如权利要求1所述的新琼二糖水解酶，其特征在于，所述的氨基酸序列为SEQIDNO:1的蛋白酶，其编码基因的核苷酸序列为SEQIDNO:2。3.如权利要求1所述的新琼二糖水解酶，其特征在于，所述的热稳定性提高的新琼二糖水解酶的氨基...

【专利技术属性】
技术研发人员：毛相朝，王其东，孙建安，刘振，黄文灿，张斌，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：山东,37