高分辨率扫描显微术制造技术

本发明专利技术涉及一种用于对样本进行高分辨率扫描显微术的显微镜和方法，照亮样本，将扫描地导引通过样本的点光斑或线光斑成像为帧，光斑按成像比例衍射受限地成像为帧并且帧静止地处于探测平面内，针对扫描位置以位置分辨率检测帧，位置分辨率在考虑成像比例的情况下至少是衍射受限的帧的半值宽度的两倍，因此检测到帧的衍射结构，针对每个扫描位置分析帧的衍射结构，产生样本的图像，图像具有超过衍射极限的分辨率，提供测器阵列，探测器阵列具有像素并且大于帧，来自探测平面的帧的射线不成像地再分配到探测器阵列的像素上，设有再分配元件，探测光线至少部分地在其光谱组成方面有所区别，射线从所述至少两个再分配元件到达探测器阵列的像素。

【技术实现步骤摘要】
高分辨率扫描显微术本申请是申请日为2014年07月18日、国家申请号为201480055894.2、专利技术名称为“高分辨率扫描显微术”的原申请的分案申请。本专利技术涉及一种用于对样本进行高分辨率扫描显微术的显微镜，具有用于照亮样本的照明装置，具有成像装置，用于在样本上扫描至少一个点光斑或线光斑并且用于按成像比例在探测平面内将点光斑或线光斑成像为衍射受限的静止的帧，具有探测器装置，用于针对不同的扫描位置以位置分辨率检测探测平面内的帧，所述位置分辨率在考虑成像比例的情况下至少是衍射受限的帧的半值宽度的两倍，具有分析装置，用于由探测器装置的数据针对扫描位置分析帧的衍射结构并且用于产生样本的图像，所述图像的分辨率超过衍射极限。本专利技术还涉及一种用于对样本进行高分辨率扫描显微术的方法，其中，照亮样本，将至少一个在样本上扫描地导引的点光斑或线光斑成像为帧，其中，点光斑或线光斑衍射受限地按成像比例成像为帧并且帧静止地处于探测平面内，针对不同的扫描位置以位置分辨率检测帧，所述位置分辨率在考虑成像比例的情况下至少是衍射受限的帧的半值宽度的两倍，从而检测帧的衍射结构，针对每个扫描位置分析帧的衍射结构并且产生样本的图像，所述图像的分辨率超过衍射极限。这种显微镜或显微术方法例如由C.MüllerundJ.Enderlein的公开出版物PhysicalReviewLetters,104,198101(2010)，或者由专利文献EP2317362A1已知，其也提及了关于现有技术的其它说明。这种方式实现了分辨率的提高，方法是将光光斑衍射受限地成像在探测平面上。衍射受限的成像将点光斑成像为艾里斑。在探测平面内这样检测衍射斑，使得能够分辨出其结构。因此，在显微镜的成像效率方面，探测器进行超采样。在成像点光斑时，分辨出艾里斑的形状。通过适当的衍射结构分析，得到了超过衍射极限2倍的分辨率提高，这种分析在所述文献中进行了描述并且其与之相关的公开内容在此完全包含在本专利技术中。然而在此在探测方面不可避免的是，对于每个在样本上以这种方式被扫描的点来说，与传统的激光扫描显微镜(以下也称为LSM)相比，必须通过大量的图像信息拍摄一个帧。如果例如以16像素检测一个光斑的帧的结构，则每个光斑不只包含16倍的数据量，单个像素平均也只包含在通常的针孔探测中照射到LSM探测器上的射线强度的1/16。因为射线强度必然不均匀地分布在帧的结构、例如艾里斑上，所以在结构边缘上的射线强度实际上甚至还明显小于在n个像素时为1/n的平均值。所要解决的问题是，能够在探测器侧以高分辨率检测射线量。通常在显微镜中使用的传统的CCD阵列不能实现足够的信噪比，因此即使延长图像拍摄时长也无济于事，而延长图像拍摄时长本身在应用中已经被视为是不利的。APD阵列也与过高的暗噪声相关，因此即使延长测量时长所得到的信噪比也不够。对于CMOS探测器同理，其还在探测器元件的尺寸方面是不利的，因为光斑的衍射受限的帧可能落在过少的像素上。PMT阵列带来了类似的结构空间问题；在该处的像素同样过大。因此，结构空间问题尤其在于，用于高分辨率的显微镜在诸如准备设备的研发开销方面只能在能集成到现有的LSM结构中的情况下实现。然而在此，预设帧的确定尺寸。只在附加地设置再次将图像显著地、也就是以多个量级扩展的光学器件时，才能安装面积较大的探测器。这种光学器件使得想在没有其它成像误差的情况下得到衍射受限的结构是非常耗费的。在现有技术中已知其它方法，它们避免在高分辨率时在所述探测方面的问题。例如在EP1157297B1中提到一种方法，其中借助结构化的照明充分利用非线性过程。结构化的照明在多个旋转和地点位置中推移经过样本并且在这些不同的状态下将样本成像在广视场探测器上，对于这些探测器不存在所述的限制。在没有所述探测器限制的情况下同样达到高分辨率(也就是超过衍射极限的样本图像分辨率)的方法由WO2006127692和DE102006021317已知。简称为PALM的方法使用标记物质，其可以借助光学激活信号被激活。标记物质只能在激活状态下被激励射线激励以发出某种荧光射线；未激活的分子即使在有激励射线入射的情况下也不会发出荧光射线。激活射线使激活物质进入一种状态，在该状态下其能够被激励以发光。因此其通常称为变换信号。这样施加所述变换信号，使得至少一定比例的被激活的标记分子与相邻的同样被激活的标记分子相间隔，使得被激活的标记分子在显微术的光学分辨率方面是分隔开的或者可事后分隔开。这称为激活的分子的隔离。对于这些被隔离的分子，能够简单地确定其由于分辨率受限所得到的射线分布的中心并且因此通过计算以比光学成像真正允许的精度更高的精度确定分子的位置。为了使整个样本成像，PALM方法利用了这个事实，即标记分子在给定的变化信号强度下通过变换信号被激活的概率对于所有标记分子来说是相同的。这样施加变换信号的强度，从而实现期望的隔离。一直重复这些方法步骤，直至尽可能所有的标记分子一次包含在已经被激励以发光的子集中。在本专利技术中，在样本上被扫描的光斑静止地成像到探测平面内。来自探测平面的射线不成像地被再分配并且被引到探测器阵列上。在此，术语“不成像地”是相对于探测平面内现有的帧而言的。帧的单个面区域当然仍可以按照成像定理成像。因此在探测器阵列与再分配元件之间均为成像的光学器件。然而，处于探测平面内的帧在再分配时不是保持不变的。术语“衍射受限”不局限于按照阿贝原理的衍射极限，而是也包括这些情况，其中理论最大值由于真实的不可接近性或限制缺少了20％。帧在这时也具有在此称为衍射结构的结构。它被超采样。这种原理实现了应用一种尺寸不与帧匹配的探测器阵列。探测器阵列优选在至少一个延伸上大于或小于待检测的帧。不同几何设计的概念既包括探测器阵列的不同延伸也包括涉及帧在探测平面内的延伸的高度和宽度的不同比例。探测器阵列的像素还可以对于所需要的分辨率是过大的。这也允许了，探测器阵列的像素布局的轮廓从根本上与帧在探测平面内的轮廓是不同的。最后，探测器阵列按照本专利技术具有与帧在探测平面中不同的尺寸。所述方法中的再分配或显微镜中的再分配元件实现了选择探测器阵列，而不需要考虑由于帧和其尺寸形成的尺寸限制和像素尺寸限制。尤其是可以将探测器排用作探测器阵列。在LSM中样本的图像通常通过以光斑扫描样本的方式由大量的帧形成，所述帧分别配属于不同的扫描位置。按照本专利技术的方案也能以并行化的形式针对多个光斑同时进行，如对于激光扫描显微镜已知的那样。由此扫描样本上的多个光斑，并且多个光斑的帧静止地并排处于探测平面内。它们随即由大小与面积相应的共同的再分配元件或者由多个单独的再分配元件进行再分配并且随即被引到相应更大的单独的或者多个单独的探测器阵列上。以下示例性地重点描述以一个单独点光斑进行的扫描。然而这不应理解为限制，并且所阐述的特征和原理实质上也适用于多个点光斑的并行扫描并且也适用于应用线光斑的情况。后者当然只是横向于线延伸地受到衍射限制，因此本说明书的与之相关的特征只适用于一个方向(横向于线延伸)。通过按照本专利技术的方式，可以在令人满意的速度下并且以可忍受的设备耗费实施ISM方法。本专利技术为高分辨率显微术原理开启了广阔的、迄今未形成的应用领域。实现再分配或再分配元件的可能性在于，使用由光导纤本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于对样本(2)进行高分辨率扫描显微术的显微镜，具有‑用于照亮样本(2)的照明装置(3)，‑成像装置(4)，用于在样本(2)上扫描至少一个点光斑或线光斑(14)并且用于在探测平面(18)内将点光斑或线光斑(14)成像为衍射受限的静止的帧(17)，‑探测器装置(19)，用于针对不同的扫描位置以位置分辨率检测探测平面(18)内的帧(17)，‑分析装置(C)，用于由探测器装置(19)的数据针对扫描位置分析帧(17)的衍射结构并且用于产生样本(2)的图像，所述图像的分辨率超过衍射极限，其中，‑探测器装置(19)具有：‑探测器阵列(24)，所述探测器阵列具有像素(25)并且大于帧(17)，和‑不成像的再分配元件(20‑21；30‑34；30‑35)，所述再分配元件布置在探测器阵列(24)之前并且将来自探测平面(18)的射线不成像地分配到探测器阵列(24)的像素(25)上，‑其中，设有至少两个同时受到探测光线加载的再分配元件，并且其中，探测光线至少部分地在其光谱组成方面有所区别，并且射线从所述至少两个再分配元件到达探测器阵列的像素，‑其中，在探测光路中设置至少一个分色器，用于产生至少两个部分光路，所述部分光路具有至少部分不同的光谱特性，‑其中，每个所述再分配元件是纤维束，所述纤维束的纤维端部终结于探测器阵列的像素处。...

【技术特征摘要】
2013.08.15 DE 102013013793.4;2013.11.15 DE 10201301.一种用于对样本(2)进行高分辨率扫描显微术的显微镜，具有-用于照亮样本(2)的照明装置(3)，-成像装置(4)，用于在样本(2)上扫描至少一个点光斑或线光斑(14)并且用于在探测平面(18)内将点光斑或线光斑(14)成像为衍射受限的静止的帧(17)，-探测器装置(19)，用于针对不同的扫描位置以位置分辨率检测探测平面(18)内的帧(17)，-分析装置(C)，用于由探测器装置(19)的数据针对扫描位置分析帧(17)的衍射结构并且用于产生样本(2)的图像，所述图像的分辨率超过衍射极限，其中，-探测器装置(19)具有：-探测器阵列(24)，所述探测器阵列具有像素(25)并且大于帧(17)，和-不成像的再分配元件(20-21；30-34；30-35)，所述再分配元件布置在探测器阵列(24)之前并且将来自探测平面(18)的射线不成像地分配到探测器阵列(24)的像素(25)上，-其中，设有至少两个同时受到探测光线加载的再分配元件，并且其中，探测光线至少部分地在其光谱组成方面有所区别，并且射线从所述至少两个再分配元件到达探测器阵列的像素，-其中，在探测光路中设置至少一个分色器，用于产生至少两个部分光路，所述部分光路具有至少部分不同的光谱特性，-其中，每个所述再分配元件是纤维束，所述纤维束的纤维端部终结于探测器阵列的像素处。2.按权利要求1所述的显微镜，其特征在于，所述再分配元件包括由光导纤维(21)组成的束(20)，其具有布置在探测平面(18)内的入口(22)和出口(23)，光导纤维(21)在出口(23)处以不同于入口(22)的几何布局终结于探测器阵列(24)的像素(25)处。3.按权利要求2所述的显微镜，其中，所述光导纤维是多模式的光导纤维。4.按权利要求2或3所述的显微镜，其特征在于，所述光导纤维这样从入口(22)延伸至出口(23)，使得在出口(23)处相邻的光导纤维(21)也在入口(22)处相邻，以便将并排的像素(25)的与射线强度有关的串扰减至最小。5.按权利要求1所述的显微镜，其特征在于，所述再分配元件包括具有倾斜程度不同的镜元件(31)的镜子(30)，其将来自探测平面(18)的射线转向至探测器阵列(24)的像素(25)上，其中，探测器阵列(24)的像素(25)具有与镜元件(31)不同的几何布局。6.按权利要求1所述的显微镜，其特征在于，所述成像装置(4)具有沿成像方向布置在探测平面(18)之前的变焦光学器件(27)，用于使帧(17)的尺寸与探测器装置(19)的尺寸适配。7.按权利要求6所述的显微镜，其特征在于，所述照明装置(3)和成像装置(4)分享一个扫描装置(10)，使得照明装置(3)对样本(2)进行照明而在其上形成衍射受限的点光斑或线光斑，而所述点光斑或线光斑与由成像装置成像的光斑(14)重合，其中，这样布置变焦光学器件(27)，使得其也是照明装置(3)的组成部分。8.按权利要求1所述的显微镜，其特征在于，所述探测器阵列(24)是探测器排。9.按权利要求8所述的显微镜，其特征在于，所述探测器排是APD或PMT排。10.按权利要求5所述的显微镜，其特征在于，所述镜子(30)是分段镜、DMD或者自适应镜。11.按权利要求1所述的显微镜，其特征在于，探测光线从再分配元件到达探测器阵列的相邻区域。12.按权利要求1所述的显微镜，其特征在于，用来自至少两个再分配元件的探测光线加载探测器阵列的至少一个像素。13.按权利要求1所述的显微镜，其特征在于，既用经滤波的光谱组成的探测光线也用无光谱滤波的探测光线加载探测器阵列的像素。14.按权利要求1所述的显微镜，其特征在于，为了进行无光谱滤波的探测，用探测光线加载比光谱滤波的探测更多的像素。15.按权利要求14所述的显微镜，其特征在于，受到上述加载的像素并排地布置和/或用来自至少两个再分配元件的光线加载像素。16.按权利要求1所述的显微镜，其特征在于，在探测光路中设置开关元件，用于启动通过未滤波的探测光线对再分配元件的加载过程。17.按权利要求1所述的显微镜，其特征在于，不同纤维束的至少两个纤维终结于探测器阵列的像素处。18.按权利要求1所述的显微镜，其特征在于，二向色镜和转向元件沿光线方向这样设置在光导体之后和探测器阵列的...

【专利技术属性】
技术研发人员：I克莱普，Y诺维考，R内茨，M戈勒斯，G洛伦茨，C尼滕，
申请(专利权)人：卡尔蔡司显微镜有限责任公司，
类型：发明
国别省市：德国,DE