鸡白蛋白-干扰素α-白介素2融合蛋白、制备方法及其编码基因、一种鸡长效干扰素技术

本发明专利技术公开了鸡白蛋白‑干扰素α‑白介素2融合蛋白、制备方法及其编码基因、一种鸡长效干扰素，将鸡白蛋白、鸡干扰素α和鸡白介素2通过柔性linker连接，得到鸡白蛋白‑干扰素α‑白介素2融合蛋白，设计优化其编码基因，最终制备得到重组鸡长效干扰素，可显著提高鸡干扰素的半衰期，较普通鸡干扰素的半衰期提高20倍以上，并具有广谱抗病毒作用并能提高鸡自身的免疫应答。

Chicken albumin-interferon alpha-interleukin-2 fusion protein, preparation method, coding gene and a long-acting chicken interferon

The invention discloses chicken albumin interferon alpha interleukin 2 fusion protein, preparation method, coding gene and a chicken long-acting interferon. Chicken albumin, chicken interferon alpha and Chicken Interleukin 2 are connected through flexible linker to obtain chicken albumin interferon alpha interleukin 2 fusion protein, and the coding gene is designed and optimized. The half-life of the recombinant chicken interferon can be significantly increased by more than 20 times than that of the common chicken interferon. The recombinant chicken interferon has broad-spectrum antiviral effect and can improve the immune response of chickens.

【技术实现步骤摘要】
鸡白蛋白-干扰素α-白介素2融合蛋白、制备方法及其编码基因、一种鸡长效干扰素
本专利技术属于生物基因工程
，具体涉及鸡白蛋白-干扰素α-白介素2融合蛋白、制备方法及其编码基因、一种鸡长效干扰素。将鸡白蛋白、鸡干扰素α和鸡白介素2通过柔性柔性linker连接，得到鸡白蛋白-干扰素α-白介素2融合蛋白，设计优化其编码基因，最终制备得到重组鸡长效干扰素。
技术介绍
近年来，随着养殖业的规模化和畜禽及其产品流通业迅速的发展，我国家禽业取得长足发展，形成了年产值逾千亿元的巨大产业。然而由于我国薄弱的动物防疫体系，禽病仍然是我国家禽生产面临的严重问题，这已经成为制约我国禽类养殖业发展的重要因素。禽病多、损失大，死亡率高于15％，死淘率达20％～25％(发达国家不足5％)，我国养鸡业每年由于传染病所导致的鸡只死亡数量约为3亿只，直接造成的经济损失约30亿元，造成的间接损失约100亿元。目前对于鸡病毒性疾病的预防和治疗主要采用的是疫苗免疫和药物治疗，由于疫苗免疫的血清型单一，病毒血清型众多且病毒毒株变异速度快，从而经常导致疫苗免疫失败。尽管一些抗生素和化学合成的抗病毒药物对少数病毒有一些作用，但由于药物残留经食物链给人类健康带来负面影响，我国从16年开始明令禁止一些抗生素和抗菌剂在养殖业中的应用。因此，积极研制生产无毒副作用、无药物残留和不产生耐药性的干扰素制剂，对目前鸡病毒性疾病预防和治疗困境有着重要的临床意义。血清白蛋白是血浆的重要成分，正常情况下不易透过肾小球，体内分布极广而且没有酶学和免疫学活性，是理想的药物载体。IFN是一类病毒感染诱导机体产生具有广谱抗病毒、抗肿瘤和具有免疫调节作用的蛋白质，1957年Issacs和Lindeman首先发现，它是一类多功能的细胞因子，与细胞受体结合后，可诱导机体产生多种特异性蛋白质和酶类，主要通过抑制病毒基因转录和降解病毒RNA来抑制病毒的生长繁殖以及发挥抗肿瘤等的活性。现已知，α型IFN在体内可有选择性地作用于病毒等感染细胞，通过抑制受染细胞内的病毒蛋白质的生物合成，发挥广谱和高效抗病毒作用。但对正常宿主细胞无作用或作用微弱。IFN-α主要生物学活性为具有抑制病毒复制、抗寄生虫、抑制多种细胞增殖、刺激免疫细胞的杀伤活性。细胞因子IL-2即白细胞介素-2，又名T细胞生长因子。主要由活化的T淋巴细胞产生的具有广泛生物活性的细胞因子，既可以促进淋巴细胞增殖，增强免疫功能，又能限制T细胞反应而增强机体的免疫耐受，故可用于治疗肿瘤、感染性疾病和自身免疫性疾病。在兽医中，由于IL-2能提高疫苗的免疫应答和减少疾病的发生，也出现广阔的应用前景。IL-2因能增强机体的免疫水平，提高机体的抗病能力，因而用于细菌性、病毒性和寄生虫性疾病的免疫治疗。此外，IL-2还可影响药物的代谢，使药物的代谢时间延长，作用时间增加，从而提高药物疗效。IL-2与其他细胞因子根据基因构建，组成融合蛋白，以增强疫苗的抗体产生和提高细胞免疫水平。天然干扰素及人工重组干扰素目前普遍存在半衰期短的局限，半衰期一般为2-4个小时。半衰期短给治疗带来了极大的不便，治疗次数的增加，相应的时间成本及经济成本随之增加，而机体的耐受极限也有可能被突破导致不良反应的产生。半衰期短的主要原因有两个：干扰素的分子量过小在体内代谢过快，干扰素尤其是重组干扰素亲和力较差被免疫系统清除。而市面上常见的长效干扰素以聚乙二醇融合干扰素为代表，仅在分子量的层面上部分解决了干扰素分子量小而导致半衰期短的问题，同时聚乙二醇融合干扰素成本非常高，不利于临床上应用。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术的目的在于提供鸡白蛋白-干扰素α-白介素2融合蛋白及其制备方法，将鸡白蛋白、鸡干扰素α和鸡白介素2通过柔性柔性linker连接，得到鸡白蛋白-干扰素α-白介素2融合蛋白。本专利技术另一目的在于提供上述鸡白蛋白-干扰素α-白介素2融合蛋白的编码基因。本专利技术还有一个目的在于提供一种长效鸡干扰素，利用上述鸡白蛋白-干扰素α-白介素2融合蛋白与冻干保护剂混合之后，经冷冻干燥制备得到一种鸡长效干扰素，所述鸡长效干扰素可显著提高鸡干扰素的半衰期，较普通鸡干扰素的半衰期提高20倍以上，并具有广谱抗病毒作用并能提高鸡自身的免疫应答。本专利技术采取的技术方案为：一种鸡白蛋白-干扰素α-白介素2融合蛋白，所述融合蛋白的氨基酸序列表如SEQUENCELISTING400〈1〉所示。本专利技术还提供的编码鸡白蛋白-干扰素α-白介素2融合蛋白的基因，所述基因的核苷酸序列表如SEQUENCELISTING400〈2〉所示，记为基因组1；或如SEQUENCELISTING400〈3〉所示，记为基因组2。所述基因组1和所述基因组2均可编码融合蛋白。基因组2是对基因组1的核苷酸序列进行优化之后的结果，通常密码子适应指数CAI＝1.0时被认为该基因在该表达系统中为最优的高效表达状态，CAI值越低表明在宿主中表达水平越低。基因中GC含量最理想分布范围为30～70％，在任何区域内超过该范围均会影响翻译和转率效率。利用软件检测发现鸡白蛋白、鸡IFN-α、鸡IL-2原始基因的密码子在大肠杆菌中密码子适应指数(CAI)分别为0.27、0.31、0.27，GC百分比为43.1％、61.7％、36.1％；而通过对鸡白蛋白、鸡IFN-α、鸡IL-2基因优化后得到各基因在大肠杆菌中密码子适应指数(CAI)为0.99、1.0、1.0，GC百分比49.2％、58.5％、46.2％。通过基因优化显著降低了低密码子的使用率，避免了稀有密码子对蛋白表达的影响，改善了基因的GC含量，提高了转录翻译效率。本专利技术还提供了含有基因组1或基因组2的表达载体。进一步地，所述表达载体为含有基因组1或基因组2的pET-32a大肠杆菌表达载体。本专利技术还提供了含有基因组1或基因组2的基因工程菌。进一步地，所述基因工程菌为pET-32a/rAlb-IFNα-IL2。含有基因组1或基因组2的宿主细胞也属于本专利技术的保护范围，进一步地，所述宿主细胞为大肠杆菌宿主细胞，更进一步地，所述大肠杆菌宿主细胞为BL21(DE3)感受态细胞或带有pGro7质粒的BL21(DE3)感受态细胞。本专利技术还提供了鸡白蛋白-干扰素α-白介素2融合蛋白的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：将含有基因组1或基因组2的表达载体导入到大肠杆菌宿主细胞中，获得基因工程菌，基因工程菌经IPTG诱导表达后得到所述融合蛋白的粗品，经纯化后即可得到融合蛋白。进一步的，所述表达载体为含有基因组1或基因组2的pET-32a大肠杆菌表达载体；进一步的，所述基因工程菌为pET-32a/rAlb-IFNα-IL2，其制备方法为：(1)、设计引物，通过反转录获得或人工分别合成连接有柔性linker序列的鸡白蛋白、鸡干扰素α和鸡白细胞介素2的目的基因；通过柔性linker将鸡白蛋白、鸡干扰素α、鸡白细胞介素2的目的基因连接起来，连接后的目的基因的核苷酸序列表如SEQUENCELISTING400〈2〉所示或如SEQUENCELISTING400〈3〉所示；(2)、将连接后的目的基因连接到pET-32a质粒上获得表达载体；(3)、将表达载体导入到大肠杆菌宿主细胞中，即可得到基因工程菌pET-32a/本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.鸡白蛋白‑干扰素α‑白介素2融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白的氨基酸序列表如SEQUENCE LISTING 400〈1〉所示，记为融合蛋白1。

【技术特征摘要】
2017.08.09 CN 20171067683481.鸡白蛋白-干扰素α-白介素2融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白的氨基酸序列表如SEQUENCELISTING400〈1〉所示，记为融合蛋白1。2.一种编码如权利要求1所述的鸡白蛋白-干扰素α-白介素2融合蛋白的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列表如SEQUENCELISTING400〈2〉所示，记为基因组1；或如SEQUENCELISTING400〈3〉所示，记为基因组2。3.含有如权利要求2所述基因的表达载体。4.含有如权利要求2所述基因的基因工程菌。5.权利要求1所述的鸡白蛋白-干扰素α-白介素2融合蛋白的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：将含有核苷酸序列表如SEQUENCELISTING400〈2〉所示的基因组1或核苷酸序列表如SEQUENCELISTING400〈3〉所示的基因组2的表达载体导入到大肠杆菌宿主细胞中，获得基因工程菌，基因工程菌经IPTG诱导表达后得到所述融合蛋白的粗品，经纯化后即可得到融合蛋白。6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述基因工程菌为pET-...

【专利技术属性】
技术研发人员：高耀辉，鲍可兵，徐慕珍，杨建伟，付超，周炜，蒋敏之，刘家炉，
申请(专利权)人：安徽九川生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽,34